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感染組織的宏基因組測(cè)序,,您選對(duì)DNA抽提方法了嗎,?
本文轉(zhuǎn)自歐易生物
前言
16S核糖體RNA基因(rRNA)的擴(kuò)增測(cè)序及分析是評(píng)價(jià)臨床標(biāo)本細(xì)菌群落多樣性常用的方法。該方法利用與16S rDNA高度保守區(qū)域結(jié)合的引物,,通過(guò)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因,,對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析獲得樣本中細(xì)菌群落的OTU,,從而判斷樣本中的微生物種類。該方法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便快速,,缺點(diǎn)是大部分微生物無(wú)法鑒定到種的水平,。
隨著測(cè)序平臺(tái)發(fā)展和測(cè)序成本的降低,人們對(duì)微生物組成的研究從系統(tǒng)發(fā)育研究(16S rRNA)轉(zhuǎn)向了宏基因組測(cè)序,。通過(guò)覆蓋微生物群落的所有物種的基因組信息,,使物種鑒定結(jié)果具有更高的特異性和敏感性。宏基因組測(cè)序還可以提供酶組成或代謝途徑,、細(xì)菌功能基因組成以及功能與系統(tǒng)發(fā)育之間的基因組聯(lián)系的遺傳證據(jù),。另外,宏基因組學(xué)不僅可以分析來(lái)自細(xì)菌源的序列,,還可以分析來(lái)自真菌,、病毒和寄生蟲的序列?;谏鲜鰞?yōu)勢(shì),,使得直接分析單個(gè)樣本中的微生物組數(shù)據(jù)成為研究臨床樣本微生物多樣性的常用方法。
然而,,在研究人類疾病與微生物之間的關(guān)系時(shí),,由于宿主DNA的污染,,宏基因組測(cè)序在實(shí)驗(yàn)上面臨巨大挑戰(zhàn),。宿主DNA與微生物DNA的共提取導(dǎo)致后續(xù)測(cè)序數(shù)據(jù)中大部分是宿主的基因組數(shù)據(jù),從而使微生物組的數(shù)據(jù)不足,,還可能產(chǎn)生干擾下游分析的非特異性信號(hào),。解決這個(gè)問(wèn)題有兩種方法:要么需要去除宿主DNA,要么需要增加測(cè)序深度以獲取足夠的微生物基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析,。然而增加測(cè)序深度可能更昂貴,,因此我們比較了幾種去除宿主DNA的微生物基因組抽提方法。
材料與方法
1)材料
糖尿病足感染樣本,;
2)方法(試劑盒)
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果展示
1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
糖尿病足感染樣本勻漿混樣,,平均分成15份,每份25mg,,用5種方法抽提DNA,,并對(duì)所得DNA進(jìn)行定量PCR及16S rDNA 擴(kuò)增測(cè)序以檢測(cè)物種多樣性。
圖1
2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-DNA質(zhì)量評(píng)價(jià)
從表1可以看出,,五種方法抽提的DNA用NanoDrop™2000c(Thermo Scientific)分光光度法測(cè)定提取的DNA產(chǎn)量和純度約為1.8(260/280),,基本符合要求。TapeStation 2200顯示DNA完整性(DIN)在7到9之間,,這表明DNA沒(méi)有碎片化(表1),。而Molzym,、QIAamp和HostZERO的260/230比值較低。根據(jù)Qiagen應(yīng)用說(shuō)明,,260/230比率低很可能是由于在基于柱的試劑盒中裂解緩沖液經(jīng)常使用的胍殘留所導(dǎo)致,,但這不影響下游qPCR檢測(cè)。
表1 不同方法抽提DNA的各項(xiàng)指標(biāo)
3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-DNA成分鑒定
使用細(xì)菌16S特異引物(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)和人18S特異引物(5’-GGTGGTGCCCTTCCGTCA-3’ 和 5’-CGATGCGGCGGCGTTATT-3’),,通過(guò)定量PCR檢測(cè)DNA樣本中宿主和細(xì)菌DNA的占比,,結(jié)果顯示,NEBNext法的宿主DNA污染程度高,,HostZERO法和QIAamp法的宿主DNA污染程度低(NEBNext>Molzym>QIAamp>HostZERO)(圖2)對(duì)照樣品18S/16S rRNA比值為0.865±0.020,。而NEBNext法和Molzym法提取的DNA樣本的18S/16S rRNA比值分別為0.701±0.022和0.393±0.057,仍然比較高,。
相比之下,,QIAamp法和HostZERO法的18S/16S rRNA比值較低,分別為0.027±0.005和0.015±0.007,,分別比對(duì)照法低了32倍和57倍,。
圖2
4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-微生物DNA占比
通過(guò)對(duì)定量PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行拷貝數(shù)計(jì)算結(jié)果表明,對(duì)照樣品中細(xì)菌DNA含量為(6.7±0.1%),。在去除宿主DNA后,,NEBNext法的細(xì)菌DNA占比仍然比較低(8.1±0.2%),Molzym法略高(13.6±1.0%),。在QiaAmp法(71.0±2.7%)和HostZero法(79.9±3.1%)中,,細(xì)菌DNA含量增加了10倍以上(圖3)。上述結(jié)果表明,,HostZERO法和Qiamp法能有效地去除宿主DNA污染,,富集微生物DNA。
圖3
5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果-16S rRNA擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果
使用16S rRNA V3V4區(qū)引物341(5‘-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806(3‘-GGACTACNNGGGTATCTAAT-5’)對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增及微生物多樣性檢測(cè),,結(jié)果表明:糖尿病足感染組織樣本微生物群共包含5個(gè)門,,這些門在該樣本中常見(jiàn)。其中,,硬壁門和放線桿菌的成員控制著細(xì)菌種群(圖4),。NEBNext與對(duì)照樣品的細(xì)菌物種組成(所有五種報(bào)告的菌門的提取)相似,,這可能是因?yàn)檫@兩組樣本的DNA提取方法(Roche)一致,,NEBNext另外增加了去宿主DNA的步驟。聚類分析也支持這一點(diǎn),,而HostZERO,、Molzym和QIAamp形成了一個(gè)單獨(dú)的聚類(圖4A和圖4B)。在屬一級(jí),鏈球菌主導(dǎo)著糖尿病足感染組織的微生物群,,其次是消化鏈球菌(圖4B),,與已有報(bào)道結(jié)果一致??偟膩?lái)說(shuō),,本研究中使用的所有微生物組DNA富集方法都成功地識(shí)別了糖尿病足感染樣本中常見(jiàn)的以及臨床上分離出的重要的屬,其豐度與先前研究中的報(bào)告相對(duì)相似,。
圖4
結(jié)論
由以上研究結(jié)果可知,,在測(cè)試的五種抽提方法獲得的DNA質(zhì)量相近,但是量的差異比較大,。不同的去宿主DNA的方法效果不一,,以HostZERO的去宿主效果好,QIAamp的效果其次,。用這幾種方法抽提的DNA進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè),,結(jié)果一致性較高,但是如果用于宏基因組測(cè)序,,HostZERO和QIAamp抽提方法可能能夠更好的去除宿主基因組的影響,。
參考文獻(xiàn)
Host DNA depletion efficiency of microbiome DNA enrichment methods in infected tissue samples, Fatemah Sadeghpour Heravi, Martha Zakrzewski, Karen Vickery, et. Al., 2020, Journal of Microbiological Methods, https://doi.org/10.1016/j.mimet.2020.105856
附表
表2 幾種宿主DNA去除方法的優(yōu)劣勢(shì)比較
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