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Protocol for using the ChemoTx® System

ChemoTx® 一次性趨化系統(tǒng) ChemoTx 系統(tǒng)是標(biāo)準(zhǔn)微孔板格式的一次性趨化/細(xì)胞遷移室,，96 孔或 384 孔。它與大多數(shù)熒光和密度測定酶標(biāo)儀,，以及大多數(shù)液體分配機器人兼容。目前有 3 個平板可用,，2 個為 96 孔板,，微孔體積為 30 或 300µ，1 個為 384 孔板,，微孔體積為 10µ,。均由組織培養(yǎng)級透明聚苯乙烯制成,。聚碳酸酯軌道蝕刻 (PCTE) 過濾器粘合到金屬框架上，并在每個測試部位周圍選擇性地涂上疏水掩模,。這種面罩允許將細(xì)胞懸液直接移液到過濾器頂部的位點上,，在那里它呈半球形液滴，從而消除了上層孔的需要,。過濾器底部和板邊緣之間的密封也由疏水面罩提供,，消除了墊圈和夾緊硬件。通過這種設(shè)計,，頂部和底部液體中的氣泡截留小化：在頂部,，因為沒有“孔”截留氣泡；在過濾器下方,，因為孔邊緣和過濾器底面之間的密封是水密封,，而不是蒸汽密封，因此氣泡可能逸出,。

使用 Neuro Probe 96 孔 ChemoTx® 系統(tǒng)填充微孔板的方案 ChemoTx®96 孔微孔板含有 30µL 或 300µL 液體,。使用 300µL ChemoTx® 板時，請參考括號中的體積,。移液器,，尤其是多通道移液器實際分配量的變化可能相當(dāng)大。為了幫助彌補這一點,，ChemoTx® 微孔板設(shè)計有碟形邊緣,。這種微孔邊緣設(shè)計允許每個微孔中的體積在 27µL-31µL (295µL-303µL) 之間，且結(jié)果良好,。相應(yīng)地,，將移液器設(shè)置為 29µL (299µL)，以便即使在遞送體積變化±2µL (±4µL) 后,，您仍處于正確范圍內(nèi),。當(dāng)微孔中的體積在 27-29µL (295-299µL) 之間時，應(yīng)用后過濾器下似乎會截留氣泡,。從上方觀察時,，微孔將是這樣的：然而，這不是一個捕獲的氣泡,?？走吘壓瓦^濾器底部之間的密封僅為水封，而非空氣密封,。因此,，當(dāng)用移液器將細(xì)胞懸液吸取到過濾器頂部時，1-2μl 培養(yǎng)基 (1-5μl) 可流經(jīng)過濾器并置換空氣

過度灌裝如果微孔過度灌裝，應(yīng)用過濾器迫使過量液體溢出邊緣并破壞水性密封件,。然后,，當(dāng)您將細(xì)胞懸液添加到過濾器頂部時，孔可能會泄漏,。下圖表示過度填充微孔的后果：n 填充不足如果您向微孔中移取的液體太少,，過濾器的底面將不會接觸液體。這可防止細(xì)胞懸液與微孔板中的液體接觸,，并捕獲孔中的空氣,，防止擴散和遷移。n 故障排除我們建議您的移液器初始設(shè)置為 29µL (299µL),。然而,，由于每個移液器不同，您可能需要優(yōu)化移液器設(shè)置,。填充一列孔并應(yīng)用過濾器,。查看過濾器頂面，查看過濾器與孔中液體接觸區(qū)域周圍是否有干燥的環(huán)狀物,。如果微孔中的液體與過濾器之間沒有接觸，則它們被填充不足,。如果有液體溢出邊緣的井,，則它們被過度填充。調(diào)整移液器設(shè)置,，以補償這些問題的出現(xiàn),。如果您正在使用多通道移液器，并且您在同一列中同時存在這兩個問題,，則：a）一個或多個吸頭與移液器之間存在泄漏,；b）一些吸頭上的污染導(dǎo)致液體分配不均；c）您的移液器太不準(zhǔn)確,，無法與 ChemoTx® 配合使用,，或 d）上述幾項。如果 a）,，重新固定移液器吸頭,；如果 b），加載新的干凈吸頭,；如果 c）或 d）,，嘗試使用不同的移液器。

如果在幾個微孔上偶爾發(fā)生輕微填充不足,，可以通過使用干凈的圓形末端玻璃攪拌棒（或類似儀器）輕輕向下推動過濾器頂部,，直至過濾器與液體接觸來克服。一旦接觸，當(dāng)在過濾器頂部移液時,，細(xì)胞懸液中的液體將取代微孔頂部的空氣,。質(zhì)控品除正常陰性質(zhì)控品外，我們還建議將已知使用的細(xì)胞懸液系列稀釋液移液到一行或一列孔中,。在這些微孔上方的過濾部位,，請勿移取細(xì)胞懸液。在這些孔中移取與過濾器頂部位置相同體積的液體為方便,。如果您正在使用 30µL 微孔板上具有 5.7 mm 微孔位點的過濾器,，則必須對該技術(shù)進行體積調(diào)整。讀取平板讀數(shù)時,，該連續(xù)稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)或度量,，與實驗孔讀數(shù)進行比較。例如,，如果實驗中每個位點使用 10000 個細(xì)胞,，則吸取 10000 個細(xì)胞到 A1 中，5000 個細(xì)胞到 B1 中,，2500 個細(xì)胞到 C1 中,，…，78 個細(xì)胞到 H1 中,。定位濾器并添加細(xì)胞懸液當(dāng)微孔板上加載化學(xué)引誘物和對照物時,，將有框濾器置于其上方，并將濾器框架角落的孔與微孔板上的四個針頭對齊,。確過濾器上的 A1 位點位于微孔板上的 A1 孔上,。向下用力按壓框架的四個角，直到其緊貼在微孔板邊緣,。注意框架必須與板的周緣接觸才能正常工作,。（參見上述照片。）
 

有框濾波器也有兩種配置,。直徑為 3.2 mm 的部位暴露面積為 8 mm2,，而直徑為 5.7 mm 的部位暴露面積為 25 mm2如果您使用的是 3.2 mm 的位點，則用移液器吸取 20µL-25µL 細(xì)胞懸液至每個位點（上述推薦的任何連續(xù)稀釋孔除外）,。如果您使用的是 5.7 mm 部位,，則移取 50µL-60µL 細(xì)胞懸液。垂直握住移液管,，緩慢均勻地擠出細(xì)胞懸液,。我們推薦一種作用緩慢、平穩(wěn)的移液器,；電子多通道移液器是該應(yīng)用的理想選擇,。請使用這些面積和體積數(shù)據(jù)，結(jié)合下表中的孔隙密度，確定待加載的適當(dāng)細(xì)胞數(shù)量和適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度,?？讖娇紫睹芏?2µm 2 x 104 孔/mm2 3µm 2 x 104 孔/mm2 5µm 4 x 103 孔/mm2 8µm 1 x 103 孔/mm2 10µm 1 x 103 孔/mm2 12µm 1 x 103 孔/mm2 讀取 ChemoTx® 過濾器和微孔板孵育后，取下蓋子,，過濾器仍在原位,，取出細(xì)胞懸液。這可以通過使用實驗室濕巾吸干來完成,。然后用小刮匙型細(xì)胞收集器或棉簽輕輕擦拭過濾器頂部的細(xì)胞,。在水槽或容器上以 45° 的角度固定微孔板和連接的過濾器，并使用介質(zhì)小心沖洗過濾器的頂面,。將培養(yǎng)基應(yīng)用于過濾器的頂部邊緣,，并使其輕輕流過過濾器表面。目標(biāo)是從頂面去除未遷移的細(xì)胞,，而不干擾已通過過濾器遷移的細(xì)胞,。