rtalabs DIAGNOVITAL®2019-NCOV

使用說明
1） 預(yù)期用途
本文介紹了實(shí)時RT-PCR檢測在體外定性檢測中的應(yīng)用
2019年呼吸道標(biāo)本和血清中的新型冠狀病毒（2019 nCoV）,。2019 nCoV引物和探針組設(shè)計(jì)用于2019 nCoV的特定檢測。
這些試劑盒遵循疾控中心和世衛(wèi)組織的新檢測指南,。
2） DIAGNOVITAL®檢測
DIAGNOVITAL®2019-NCOV是基于RT-PCR的2019武漢冠狀病毒（2019-NCOV）實(shí)時檢測系統(tǒng),。2019年nCoV被認(rèn)為是一種新的人類冠狀病毒，與引起季節(jié)性急性呼吸系統(tǒng)疾病的常見人類冠狀病毒（229E,，NL63,，OC43，HKU1）有著明顯的遺傳差異,。它在基因上也不同于兩個新人類
冠狀病毒,、MERS-CoV和SARS-CoV,。

DIAGNOVITAL®2019-NCOV檢測到2019年NCOV存在3個不同且高度特異的基因序列：E基因、N基因和RdRP基因,。所有3項(xiàng)化驗(yàn)必須檢測為陽性,，以確認(rèn)樣本為2019 nCoV陽性。
此外,，還包括非感染性陽性對照和陰性人類提取對照,。陽性對照用于確認(rèn)分析的功能和總體PCR性能，陰性人類提取對照用于評估獨(dú)立于2019年nCoV分析的RNA分離質(zhì)量,。

2.1）基于QPCR的2019-NCOV檢測
檢測2019株nCoV的一步是將病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。之后,，通過熒光標(biāo)記探針,，對2019年nCoV*的目標(biāo)序列進(jìn)行實(shí)時放大監(jiān)測：當(dāng)加入新擴(kuò)增的DNA鏈時，熒光團(tuán)（FAM™) 被釋放,，可以觀察到熒光信號的增加,。
由于冠狀病毒的固有突變率，目標(biāo)序列中的突變有可能隨著時間的推移而發(fā)生和積累,。這可能導(dǎo)致基于PCR的檢測方法出現(xiàn)假陰性結(jié)果,。DIAGNOVITAL®2019-NCOV通過對3個不同的目標(biāo)序列使用3種檢測分析來解決此問題，以大限度地減少由改變的目標(biāo)序列導(dǎo)致假陰性結(jié)果的機(jī)會,。
如果樣品在一個或多個分析中檢測為陰性,，則可能需要額外的補(bǔ)充檢測。2019年nCoV的原始靶序列作為非感染性靶陽性對照（TPC）包括在內(nèi),，以檢查檢測分析的完整性,。
應(yīng)始終通過補(bǔ)充方法和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室中的附加分析來確認(rèn)檢測呈陽性的樣品。

PRODUCT SIZE SKU

DIAGNOVITAL®2019-NCOV

50 rxn / 20 µl PCC

SKU15259

2.2) MATERIALS PROVIDED

QUANTITY AND VOLUME COMPONENT

2.3）所需附加材料
•核酸提取的適當(dāng)方法和設(shè)備（見第3.4章）
•為FAM配備實(shí)時PCR檢測系統(tǒng)™ 偵查
•可調(diào)移液管和安裝過濾移液管頭
•適當(dāng)?shù)腜SA和工作區(qū),，用于處理潛在感染性樣本
•表面去污劑,，如DNAZap™ （生命科技），遠(yuǎn)離DNA™ （費(fèi)舍爾科學(xué)）,，離開™ （Fisher Scientific）,，10%漂白劑（市售5.25-6.0%次氯酸鈉的1:10稀釋度）
•無核酸酶管/條/板，用于制備稀釋液,、主混合物等,；與PCR裝置相對應(yīng)的無核酸酶管/條/板
•試劑和樣品的適當(dāng)儲存選擇（4℃、-20℃,、-70℃）

2.4）儲存
•將所有部件儲存在-20°C下,，避免重復(fù)凍融循環(huán)。•保護(hù)2X qPCR主混合料不受光照,，因?yàn)殚L時間曝光會降低熒光粉的性能,。

3） 開始前的注意事項(xiàng)
3.1）生物安全•穿戴適當(dāng)?shù)膫€人防護(hù)裝備（如長袍,、無粉手套，
當(dāng)使用臨床樣本時,。•應(yīng)按照生物安全2級或更高級別的指南,，在經(jīng)認(rèn)證的二級生物安全柜中進(jìn)行樣本處理。

3.2）試樣
僅使用適當(dāng)?shù)臉颖具M(jìn)行測試,，例如：•呼吸樣本,，包括鼻咽/口咽抽吸物或沖洗液、鼻咽/口咽拭子,、支氣管肺泡灌洗液,、氣管抽吸物和痰。•拭子樣本只能在帶有合成的拭子上采集（例如
聚酯或滌綸（帶鋁或塑料軸）,。不接受含有海藻酸鈣的棉簽或帶有木軸的棉簽
3.3）試樣-搬運(yùn)和儲存
•采集后,，樣品可在4°C下保存72小時。
•如果預(yù)計(jì)提取會延遲,，則將樣品儲存在-70°C或更低的溫度下,。
•提取的核酸應(yīng)儲存在-70°C或更低的溫度下。
如果
•未將其保存在2-4°C（≤4天）或在-70°C或更低溫度下冷凍,。
•標(biāo)簽不足或缺乏文件,。
•它們不適用于此目的（有關(guān)合適的樣品材料，見上文）,。
•樣本容量不足,。

3.4）樣品制備/核酸提取：RT-PCR檢測的性能很大程度上取決于樣品模板RNA的量和質(zhì)量,。強(qiáng)烈建議在測試樣本之前,，對回收和純度的RNA提取程序進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。•與DIAGNOVITAL®檢測試劑盒成功結(jié)合使用的合適核酸提取系統(tǒng)包括：bioMérieux NucliSens®系統(tǒng),、QIAamp®病毒RNA小試劑盒,、QIAamp®Minelote病毒自旋試劑盒或RNeasy®小試劑盒（QIAGEN）、EZ1 DSP病毒試劑盒（QIAGEN）,、Roche MagNA Pure Compact RNA分離試劑盒,、Roche MagNA Pure
緊湊型核酸分離試劑盒、羅氏麥格納純96 DNA和病毒核酸小容量試劑盒,、Invitrogen ChargeSwitch®總RNA細(xì)胞試劑盒,。
•將剩余樣本和提取的核酸保存在-70°C下。•僅解凍一天內(nèi)要測試的樣本提取物數(shù)量,。

•測試前不要冷凍/解凍提取物超過一次,，因?yàn)槊看卫鋬?解凍循環(huán)都會降低RNA質(zhì)量。•根據(jù)樣本類型,，可以直接使用患者樣本,。
然而,，這可能需要預(yù)先的溶解步驟和滴定樣品上的量，可以在不抑制反應(yīng)的情況下使用,。此過程尚未驗(yàn)證,，請使用
建議分離RNA。
3.5）反應(yīng)裝置
1） 在開始實(shí)驗(yàn)之前,，確保所有必要的設(shè)備和裝置都是合適的,、校準(zhǔn)的和功能正常的。
2） 對設(shè)備和工作區(qū)進(jìn)行凈化,，并準(zhǔn)備好以下實(shí)驗(yàn)所需的一切,，以保持工作流程的簡短和可重復(fù)性。
3） 打開PCR檢測系統(tǒng)并對其進(jìn)行編程,，以避免在設(shè)置反應(yīng)后出現(xiàn)延遲,。
4） 在冰上解凍DIAGNOVITAL®2019-NCOV的所有成分，并輕輕但*地混合,，以確保成分均勻分布?？焖傩D(zhuǎn)收集管底部的液體,。
5） 對于一個測試，準(zhǔn)備一系列的RNA稀釋來確定理想的濃度窗口,。建議的樣品體積小于終反應(yīng)體積的10%,。
6） 設(shè)置Mastermix板：

a、 務(wù)*無核酸酶的二氧化二氫（dH2O）代替樣品材料（NTC）制備對照反應(yīng),，以檢測試劑中的污染,。
b、 始終包括陰性人類提取控制（HEC）的分析,，以評估您的RNA分離物的質(zhì)量,。
c、 當(dāng)使用提供的靶陽性對照品（TPC）時,，使用1微升/反應(yīng),，并將無核酸酶的dH2O添加到20微升。
d,、 強(qiáng)烈推薦2份以上的復(fù)制品/樣品,。
e、 為所有計(jì)劃的反應(yīng)準(zhǔn)備足夠的混料,。建議為2個附加反應(yīng)制備mastermix,，以補(bǔ)償移液誤差。
f,、 將混合料分發(fā)到板條/盤子中,。示例設(shè)置如圖1所示,。

OMPONENT VOLUME

50X DIAGNOVITAL®Reverse Transcriptase 0.4 µl

DIAGNOVITAL®2X qPCR Mastermix (E / N / RdRP / HEC) 10 µl

isolated sample RNA / TPC X µl / 1 µl

Nuclease-free dH2O to 20 µl

7） 將Mastermix板轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的工作區(qū)以添加樣品材料。
在單獨(dú)的工作區(qū)準(zhǔn)備試劑和終反應(yīng)裝置有助于避免設(shè)備和試劑與樣品材料的污染,。
a,、 在處理陽性樣品之前，先準(zhǔn)備好陰性反應(yīng)并密封,。建議在制備和密封NTC后,，僅將潛在陽性樣品材料和包含的目標(biāo)陽性對照品帶到工作區(qū)。
b,、 將您的樣品添加到Mastermix板中,。示例設(shè)置如圖2所示。