viennalab CYP2C19說(shuō)明書(shū)

CYP2C19基因的變異會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)藥物或藥物代謝物的濃度過(guò)高,，從而可能導(dǎo)致毒性,，藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)或藥物功效受損。的PGX-CYP2C19 StripAssay ^® 檢測(cè)導(dǎo)致減少或增加的細(xì)胞色素P450同工酶的CYP2C19活性的遺傳變體。

PGX-CYP2C19StripAssay®

• 攜帶CYP2C19變體的患者可能需要調(diào)整被該酶代謝的藥物的劑量。
• CYP2C19功能喪失的等位基因（* 2-* 8）與接受氯吡格雷的患者復(fù)發(fā)性心血管事件發(fā)生率較高相關(guān),，但與接受質(zhì)子泵抑制劑的患者應(yīng)答性改善相關(guān)。
• CYP2C19 * 17功能獲得的等位基因可能會(huì)導(dǎo)致藥物治療失敗,，例如在質(zhì)子泵抑制劑或抗抑郁藥治療中失敗,。

產(chǎn)品詳情

PGX-CYP2C19StripAssay®

4-750

1. Lysis Solution 50 ml

2. GENXTRACT Resin 5 ml

Resuspend each time immediately before removing an aliquot.

3. Amplification Mix (yellow cap) 500 µl

4. Taq Dilution Buffer (transparent cap) 500 µl

5. DNAT (blue cap) 1.5 ml R 36/38

6. Typing Trays 3

7. Teststrips 20

8. Hybridization Buffer (white cap) 25 ml

9. Wash Solution A (white cap) 80 ml

10. Conjugate Solution 25 ml

11. Wash Solution B 80 ml

12. Color Developer 25 ml

使用說(shuō)明

一、預(yù)期用途

基于聚合酶的細(xì)胞色素（cyp）2c19基因突變檢測(cè)

鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和反向雜交,。

二,。方法

這個(gè)過(guò)程包括三個(gè)步驟：（1）DNA分離，（2）生物素化PCR擴(kuò)增

引物,，（3）擴(kuò)增產(chǎn)物與含有等位基因特異性的試紙條雜交

寡核苷酸探針固定成平行線陣列（圖1）,。結(jié)合生物素

用鏈霉親和素堿性磷酸酶和彩色底物檢測(cè)序列,。

該方法包括8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)：c.681g>a（2c19*2），c.636g>a（2c19*3）,，c.1a>g,。

（2c19*4），c.1297c>t（2c19*5）,，c.395g>a（2c19*6），c.819+2t>a（2c19*7）,，c.358t>c

（2C19*8）,，C.-806C>T（2C19*17）。

更多的遺傳信息可在OMIM在線孟德?tīng)柸祟?lèi)遺傳：

www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

三,、套件組件

見(jiàn)一頁(yè)所有組件清單,。

脫氧核糖核酸含1.6%氫氧化鈉（r 36/38）。

放大混合物,，TAQ稀釋緩沖液,，共軛溶液，洗滌液B含0.05%

奶奶3,。結(jié)合液中含有鏈霉親和素堿性磷酸酶,。彩色顯影劑

含有硝基藍(lán)四唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）。

不使用時(shí),，將所有試劑儲(chǔ)存在2-8°C,！

四、需要但未提供的材料

除了標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備外,，還需要以下設(shè)備：

•可調(diào)微型離心機(jī),，轉(zhuǎn)速3000-12000轉(zhuǎn)/分（1000-12000 x g）

•培養(yǎng)箱（例如加熱塊、水?。?，溫度分別為56°C和98°C（±2°C）

•熱循環(huán)器和合適的薄壁塑料反應(yīng)管/帶

•TAQ DNA聚合酶

•帶振動(dòng)臺(tái)和可調(diào)溫度的水浴槽（45°C±0.5°C）

•真空抽吸裝置

•振動(dòng)篩（搖桿或軌道振動(dòng)篩）

•可選：瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備（用于擴(kuò)增產(chǎn)物的控制）

分析程序

一。DNA分離

新鮮或冷凍的血液中加入edta或檸檬酸抗凝劑,；避免血液中含有肝素,。

在室溫下儲(chǔ)存血液的時(shí)間不得超過(guò)3天，在2-8°C下儲(chǔ)存血液的時(shí)間不得超過(guò)1周

使用前,。冷凍一年以上,，或經(jīng)歷多次

三次以上的凍融循環(huán)不適合用于此程序。

把血樣帶到室溫,。小心倒置采血管,，充分混合

好幾次。每次取血前重復(fù)混合,。

使裂解液和genxtract樹(shù)脂達(dá)到室溫,。

•用帶螺帽的1.5毫升微管吸取100微升血液樣本,。

•加入1毫升裂解液，合上試管,，倒置數(shù)次混合,。

•室溫下靜置15分鐘。

•在微型離心機(jī)中以3000轉(zhuǎn)/分（約1000 x g）離心5分鐘,。

•取下并丟棄上層（頂部）1毫升上清液,。

•加入1毫升裂解液，合上試管,，倒置數(shù)次混合,。

•在微型離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分（約12000 x g）離心5分鐘。

•除去并丟棄上清液,，但約50微升可見(jiàn)的軟顆粒除外,。

•*旋轉(zhuǎn)瓶子，重新使用Genxtract樹(shù)脂,。

•向顆粒中添加200微升Genxtract樹(shù)脂,。關(guān)閉管和渦流10秒。

樹(shù)脂沉積迅速,。每次立即重復(fù)再懸浮

在移除另一個(gè)等份之前,。

•在56°C下孵育20分鐘，渦流10秒,。

•在98°C下孵育10分鐘,，渦流10秒。

•在微型離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,。冰上涼快,。

所得到的上清液含有適于在pcr中立即使用的dna模板。為了

進(jìn)一步儲(chǔ)存時(shí),，上清液應(yīng)轉(zhuǎn)移到新鮮的試管中并保持冷藏,。

（2-8°C；多一周）或冷凍在-20°C,。

2.體外擴(kuò)增（PCR）

將所有PCR試劑和DNA模板冷藏,。執(zhí)行所有步驟直到開(kāi)始

冰上熱循環(huán)程序（0-4°C）。

•在TAQ稀釋緩沖液中制備新的TAQ DNA聚合酶工作稀釋液（0.2 U/微升）

（透明蓋）,。

•為每個(gè)待放大的樣品準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)管,。把管子放在冰上,。

•對(duì)于每個(gè)樣品,，在冰上制備終PCR反應(yīng)混合物：

15微升放大混合物（黃蓋）

5微升稀釋TAQ DNA聚合酶（1U）

5微升DNA模板

如果使用的DNA模板不是由試劑盒分離協(xié)議（第V/1章）制備的,，則

建議濃度范圍為5-40微克/毫升（=每個(gè)反應(yīng)25-200納克DNA）。

把管子蓋緊。將熱循環(huán)器預(yù)熱至94°C,。

•插入反應(yīng)管并運(yùn)行以下熱循環(huán)程序：

預(yù)PCR:94°C/2分鐘,。

熱循環(huán)：94°C/15秒。-58攝氏度/30秒,。-72攝氏度/30秒,。（35個(gè)循環(huán)）

終延伸：72°C/3分鐘。

將放大產(chǎn)品存放在冰上或2-8°C下,，以備進(jìn)一步使用,。

可選：用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物（如3%瓊脂糖凝膠）。

片段長(zhǎng)度：288254218182161146bp

三,。雜交（45°C,；振蕩水浴）

將水盆的水位調(diào)整到打字托盤(pán)高度的約1/2,。

將水浴加熱至45°C（±0.5°C）。用校準(zhǔn)過(guò)的

溫度計(jì),。

預(yù)熱雜交緩沖液并將溶液A洗滌至45℃（注意所有沉淀

在2-8°C下形成,，*溶解。）

使試紙,、DNAT,、共軛溶液、洗滌溶液B和顯色劑達(dá)到

室溫,。準(zhǔn)備打字托盤(pán),。

使用干凈的鑷子為每個(gè)樣品取下一個(gè)測(cè)試條。（用手套觸摸測(cè)試條

只有?。┯勉U筆在標(biāo)記線外標(biāo)記測(cè)試條,。（沒(méi)有圓珠筆，馬克筆,，

等）

•將10微升DNAT（藍(lán)帽）吸管插入每個(gè)通道的下角,，用于打字

托盤(pán)（每個(gè)樣品一條通道）。

•將10微升擴(kuò)增產(chǎn)物加入相應(yīng)的DNA滴中,。

用吸管*混合,。（解決方案將保持藍(lán)色。）

•室溫下靜置5分鐘,。

•在每個(gè)通道中加入1毫升雜交緩沖液（預(yù)熱至45°C）,。

輕輕攪動(dòng)托盤(pán)。（藍(lán)色將消失,。）

•插入帶有標(biāo)記的測(cè)試條（可見(jiàn)線條?。┻M(jìn)入各自的車(chē)道。潛入

*。

•在水浴的搖床上,，在45°C下培養(yǎng)30分鐘,。

設(shè)置適當(dāng)?shù)恼饎?dòng)頻率（約50轉(zhuǎn)/分）以避免溢出。保持

水盆關(guān)閉以避免溫度變化,。

•孵化結(jié)束時(shí),，通過(guò)真空抽吸去除雜交溶液。

立即進(jìn)行,。在整個(gè)過(guò)程中,，不要讓測(cè)試條干運(yùn)行。

四,。嚴(yán)格清洗（45°C,；搖晃水浴）

•加入1毫升洗滌液A（預(yù)熱至45°C）,。短暫沖洗（10秒）,。

通過(guò)真空抽吸除去液體。

•加入1毫升洗滌液A（45°C）,。

•在45°C的搖動(dòng)水浴中培養(yǎng)15分鐘,。

通過(guò)真空抽吸除去液體。

•加入1毫升洗滌液A（45°C）,。

•在45°C的搖動(dòng)水浴中培養(yǎng)15分鐘,。

通過(guò)真空抽吸除去液體。

5個(gè),。顯色（室溫）

•加入1毫升共軛溶液,。

•室溫下在搖床或軌道振動(dòng)篩上培養(yǎng)15分鐘。

通過(guò)真空抽吸除去液體,。

•加入1毫升洗滌液B,。短暫沖洗（10秒）。

通過(guò)真空抽吸除去液體,。

•加入1毫升洗滌液B,。

•室溫下在搖床或軌道振動(dòng)篩上培養(yǎng)5分鐘。

通過(guò)真空抽吸除去液體,。

•加入1毫升洗滌液B,。

•室溫下在搖床或軌道振動(dòng)篩上培養(yǎng)5分鐘。

通過(guò)真空抽吸除去液體,。

•加入1毫升顯色劑,。

•在室溫下，在搖床或軌道振動(dòng)篩上黑暗中培養(yǎng)15分鐘,。

陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)紫色染色,。

•用蒸餾水清洗測(cè)試條數(shù)次,。

在暗處用吸水紙把紙條晾干。

顏色顯影后,，不要將試紙置于強(qiáng)光下,。

六、結(jié)果解釋

樣本的基因型是用所附的collectorTM表確定的,。

將處理過(guò)的測(cè)試條放入字段之一,，將其與示意圖對(duì)齊

使用紅色標(biāo)記線（頂部）和綠色標(biāo)記線（底部）繪制，并用

膠帶,。

上面控制線的正反應(yīng)表示共軛的正確函數(shù)

溶液和顯色劑,。這條線應(yīng)該總是染色陽(yáng)性。

對(duì)于每個(gè)多態(tài)性位置,，應(yīng)獲得以下染色模式之一：

注意：陽(yáng)性線的染色強(qiáng)度可能不同,。這對(duì)結(jié)果沒(méi)有意義。