Cytoskeleton,，Inc.成立于1993年,。自成立以來,，我們一直在不斷擴大產(chǎn)品范圍。

Cytoskeleton,，Inc.很高興為藥物篩選,，信號轉(zhuǎn)導和細胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chǎn)品。我們專注于純化蛋白的生產(chǎn)和易于使用的試劑盒，以研究生化和細胞過程,。我們的試劑盒既可用于基礎研究或小型篩查的少量樣品（Biochem Kits™）,，也可用于大型篩查的高通量規(guī)模（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們現(xiàn)有的產(chǎn)品,，我們還提供產(chǎn)品系列中微管,，微管蛋白，運動蛋白,，小G蛋白效應物,，GAP，GEF和其他幾種蛋白的藥物篩選服務,。

cytoskeleton BK033-S說明書

Arf6 Pull-down Activation Assay Biochem Kit (bead pull-down format) - 20 Assays

Amount

20 assays  (Cat. # BK033-S)

產(chǎn)品用途包括

• 分析體內(nèi) ARF6激活,。
   

介紹

與Ras相關的小G蛋白的哺乳動物ADP核糖基化因子（Arf）亞家族初被命名為具有刺激霍亂毒素介導 的許多GPCR使用的_Gsα亞基的ADP核糖基化的能力（1）。根據(jù)其大小和氨基酸相似性,，將Arf GTPases分為三類：I類（Arf6和Arf3）,，II類（Arf4和Arf5）和III類（Arf6）。Arf6的主要作用之一是蛋白質(zhì)從質(zhì)膜轉(zhuǎn)運到內(nèi)吞區(qū)室（例如GPCR）,，并且似乎在某些GPCR的順行轉(zhuǎn)運中起作用（3,、4）。像Arf1一樣,，Arf6部分地通過脂質(zhì)修飾酶的激活來改變局部膜環(huán)境（3）。

與其他小G蛋白一樣,，Arf6在無效的GDP結合狀態(tài)和有效的GTP結合狀態(tài)之間循環(huán),。效應蛋白與GTP結合的Arf6與GDP結合的狀態(tài)的優(yōu)先結合為Arf6在細胞中的功能提供了基礎。效應蛋白與Arf6-GTP的這種高度特異性的聯(lián)系已被用于開發(fā)親和沉淀測定法以監(jiān)測Arf6的活化（5）,。

細胞骨架的Arf6活化檢測法Biochem Kit™利用效應蛋白GGA3（含有高爾基體的γ-耳,，含有Arf結合蛋白3）的Arf6蛋白結合域（PBD），該蛋白已被證明與GTP結合形式Arf6（5,，6）,。我們已經(jīng)在大腸桿菌中共價結合了純化的GGA3-PBD（氨基酸1-316）試劑盒中提供的彩色瓊脂糖珠（圖1）。使用這些珠子,，研究人員能夠使用該試劑盒中提供的Arf6特異性抗體,，“下拉” Arf6-GTP并定量活性Arf6的水平，隨后進行蛋白質(zhì)印跡步驟,。該測定法提供了一種分析各種系統(tǒng)中細胞Arf6激活水平的簡單方法,。下面的圖2顯示了典型的Arf6下拉測定法，使用的是GTPγS和GDP負載的MDCK細胞提取物,，或已經(jīng)收獲并保持懸浮狀態(tài)或鋪在纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿中的MDCK細胞提取物（例如,，參見參考文獻7， 8）。

試劑盒內(nèi)容
試劑盒包含足夠的材料,，可用于20種測定,，具體取決于測定的設置，并包括用于陽性和陰性對照的試劑,。包括以下組件：

1. GGA3-PBD磁珠（目錄號GGA05）
2. Arf6單克隆抗體（目錄號ARF06）
3. His標記的Arf6蛋白
4. GTPγS：（不可水解的GTP類似物）（目錄號BS01）
5. 國內(nèi)生產(chǎn)總值
6. 細胞裂解液
7. 洗滌緩沖液
8. 加載緩沖
9. 停止緩沖區(qū)
10. 蛋白酶抑制劑混合物（目錄號PIC02）
11. 二甲基亞砜
12. 帶有詳細協(xié)議的手冊和詳盡的故障排除指南

結果示例

圖2顯示了典型的Arf6下拉測定法，使用的是GTPγS和GDP負載的MDCK細胞提取物,，或者是已收獲并保持懸浮狀態(tài)或鋪在纖連蛋白包被的培養(yǎng)皿上的MDCK細胞提取物（例如,，參見參考文獻7、8 ）,。
 

圖2.  Arf6激活測定Biochem Kit™下拉測定結果,。
 

上：  使用產(chǎn)品手冊第VI節(jié)：對照反應中所述的方法，將裝有GTPγS（GTP泳道）或GDP（GDP泳道）的MDCK細胞裂解液（500 µg）裝滿,。  

底部：  從懸液中懸浮2小時（Sus）或在組織培養(yǎng)板（Rp）上生長的細胞獲得的MDCK細胞裂解物（500 ug）,。所有提取物均與20μgGGA3-PBD珠一起孵育，并按照產(chǎn)品手冊第VI節(jié)：Pulldown分析中所述進行處理,。將所有珠子樣品重懸于20 µl 2x樣品緩沖液中,，然后在4-20％SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)移至PVDF,，以1：250稀釋的抗Arf6抗體進行探測,，并按照所述方法進行化學發(fā)光檢測在產(chǎn)品手冊的第六節(jié)：STEP 4中。

參考文獻

1. Kahn,，RA,，和Gilman，AG（1986）,，霍亂毒素對Gs進行ADP-核糖基化的蛋白質(zhì)輔因子本身就是GTP結合蛋白,。J.Biol?；瘜W 261,，7906-7911。
2. Tsuchiya,，M.,，Price，SR,，Tsai,，SC，Moss,，J,。和Vaughan，M。（1991）ADP-核糖基化因子mRNA的分子鑒定及其在哺乳動物細胞中的表達,。J.Biol,。化學 266,，2772-2777,。
3. D'Souza-Schorey，C.和Chavrier,，P.（2006）ARF蛋白：在膜運輸及其他方面的作用,。納特 牧師 細胞生物學。7,，347-358,。
4. Wang，G.和Wu,，G.（2012）GPCR順行販運的小GTPase調(diào)控,。趨勢藥理學?？茖W 33,，28-34。
5. Cohen,，LA和Donaldson,，JG（2010）分析Arf GTP結合蛋白在細胞中的功能。Curr,。協(xié)議,。細胞生物學。48,，14.12.1-14.12.17。
6. Takatsu,，H.,，Yoshino，K.,，Toda,，K.和Nakayama，K.（2002）GGA蛋白通過其GGAH結構域和ADPribosylation因子之間的相互作用與高爾基膜結合,。 生化,。J.  365，369-378,。
7. Balasubramanian,，N.，Scott，DW,，Castle,，JD，Casanova,，JE和Schwartz,，M.A.（2007）Arf6和微管在脂筏的黏附依賴性轉(zhuǎn)運中。納特 細胞生物學,。9,，1381-1391。
8. Goldfinger,，LE,，Ptak，C.,，Jeffery,，ED，Shabanowitz,，J.,，Hunt，DF,，和Ginsberg,，MH（2006）RLIP76（RalBP1）是一種R-Ras效應子，介導粘附依賴性Rac活化和細胞遷移,。J.細胞生物學,。174，877-888,。