amquar.達(dá)克珠單抗

Daclizumab（達(dá)珠單抗高產(chǎn)法）是一種人源化單克隆抗體,，可與白細(xì)胞介素-2受體的α-亞基（CD25）結(jié)合，有利地調(diào)節(jié)多發(fā)性硬化癥（MS）的免疫環(huán)境,。

目錄號(hào)

MA1018

純度

> 97％的

規(guī)格

2毫克/毫升

• 生物活性

   

  Daclizumab（達(dá)珠單抗高產(chǎn)法）是一種人源化單克隆抗體,，可與白細(xì)胞介素-2受體的α-亞基（CD25）結(jié)合，有利地調(diào)節(jié)多發(fā)性硬化癥（MS）中的免疫環(huán)境,。

  達(dá)克珠單抗與CD25的結(jié)合，Kd值為4.5nM。[1]

  Daclizuma在體外抑制IL-2依賴的KIT225 / K6細(xì)胞增殖,，IC50為3.14nM [1]。

   

• 體外研究

   

• 體內(nèi)研究

   

• 激酶實(shí)驗(yàn)

   

  使用表面等離子體共振進(jìn)行等離子體共振結(jié)合表征[1]

   

  抗體結(jié)合特性werecharacterized以確定針對可溶性,，重組人IL-2R的結(jié)合相互作用速率常數(shù)（ka和KD）和親和常數(shù)（KD） α 使用Biacore技術(shù)（CD25）,。使用伯胺共價(jià)偶聯(lián)化學(xué)將每種抗體材料固定在芯片表面上。使用自動(dòng)方法以不同濃度一式兩份和參照表面注射重組CD25 2分鐘,。使用參考流動(dòng)池和緩沖液空白校正結(jié)合數(shù)據(jù),。使用新制備的傳感器表面復(fù)制測定，然后使用二價(jià)模型將結(jié)合數(shù)據(jù)與BIAevaluation軟件擬合以獲得用于動(dòng)力學(xué)評估的平衡常數(shù),。

   

   

• 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

   

  細(xì)胞培養(yǎng)和效應(yīng)細(xì)胞的分離[1]

   

  使用基于細(xì)胞的方法測定直接抑制IL-2依賴性高親和力IL-2受體介導(dǎo)的增殖的相對抗體生物學(xué)效力,，該方法評估滴定的抗體濃度對人白血病細(xì)胞系KIT225 / K6.28 PBMC增殖的影響。用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度分離并用作ADCC測定中的效應(yīng)細(xì)胞,。在另外的ADCC實(shí)驗(yàn)中,，分別使用針對CD14和CD56的EasySepTM人CD34陽性選擇試劑盒從PBMC培養(yǎng)物中除去單核細(xì)胞和NK細(xì)胞，并使用RobosepTM自動(dòng)細(xì)胞分離系統(tǒng)的制造商方案,。通過流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)靶細(xì)胞消耗大于95％,。所有血液均來自知情同意的健康志愿者，并且未對個(gè)體供體進(jìn)行基因分型,。

  ⁵¹ Cr標(biāo)記靶細(xì)胞

  KIT225 / K6細(xì)胞在RPMI 1640*培養(yǎng)基（10％熱滅活的胎牛血清加補(bǔ)充物）中生長,。KIT225 / K6cells以2×10的終濃度懸浮在0.5毫升試驗(yàn)培養(yǎng)基（RPMI 1640,10％熱inactivatedfetal牛serumplus補(bǔ)充劑）^7個(gè)細(xì)胞/ mL，并用500標(biāo)記的 μ 次的⁵¹鉻（50 μ 次/ 10 ⁶個(gè)細(xì)胞）在37溫育^Ô在水浴中1個(gè)小時(shí)withoccasional混合℃,。用12mL AssayMedium洗滌標(biāo)記的細(xì)胞4次,。使用Beckman Gamma5500B計(jì)數(shù)器靶標(biāo)記的效率進(jìn)行評價(jià)，并認(rèn)為是可接受的,，如果有在least20,000 CPM / 10的活動(dòng)⁵細(xì)胞,。標(biāo)記的靶細(xì)胞在測定培養(yǎng)基中以2.5×10 ⁵細(xì)胞/ mL的細(xì)胞密度懸浮，或在CDC測定培養(yǎng)基中以5.0×10 ⁵細(xì)胞/ mL懸浮,，視情況而定,。

  補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性測定

  將抗體在含有RPMI 1640,0.1％BSA和10mM HEPES的CDC AssayMedium中連續(xù)稀釋。50 μ 洛夫⁵¹ Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞（25,000cells /孔）加入到wellsof amicrotiter U型底96孔板中,，然后在50體積 μ 加入測試抗體的LOF系列稀釋,。25 μ 升8％的Triton X-100的and25 μ CDC分析培養(yǎng)基升加入到大釋放孔中,，并50 μ LOF CDC分析培養(yǎng)基加入到自發(fā)釋放的孔（一式四份）。50 μ LOF 1/3稀釋度的人血清池的溶液中加入于參考和testsample井,。三分之一稀釋的熱滅活的（30分鐘將50ml在56 ^öC）將人合并的血清加入補(bǔ)體非依賴性對照,，大釋放和自發(fā)釋放孔中。通過鑒定特異性活性大的濃度而非特異性活性小化來預(yù)先建立宜的人合并血清濃度,。測定板incubatedfor 2小時(shí),，在37 ^Ô在7.5％CO c ^ ₂培養(yǎng)箱然后紡at350 RCF在室溫下5分鐘。75的體積 μ LOF上清液轉(zhuǎn)移托米尼管,，和eachmini-管插入intoa閃爍小瓶中并計(jì)數(shù)1分鐘在Beckman伽瑪5500B計(jì)數(shù)器,，或等同物。匯集的人血清使用靜脈穿刺和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從Quidel Corporation或健康志愿者獲得,。

  用于CDC活性的陽性對照抗體是人源化IgG1 / k抗體Hu＃4,，其對于跨HLA-DR具有結(jié)合特異性。用于CDC和ADCC活性的陰性對照抗體具有對HSV病毒抗原具有結(jié)合特異性的人源化IgG1 / k抗體HuFd79,。報(bào)告為百分比特異性裂解的值使用以下公式得出：特異性裂解百分比=（（抗體治療計(jì)數(shù)每分鐘（CPM） - 自發(fā)性CPM）/（大CPM - 自發(fā)性CPM））×100,。

  抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性測定

  ⁵¹鉻labeledKIT225 / K6細(xì)胞（12500個(gè)細(xì)胞/孔）預(yù)溫育以1:1的fixedconcentration μ克/毫升的mAb（用于可變效應(yīng)物與靶[E：T]比率格式）orvarious劑量（5,1，0.2 ,，0.04％,，0.008，和0.0016 μ克/毫升）的mAb（用于可變抗體濃度格式）處理30分鐘,，在4 ^Ó在100體積CIN V-bottom96-孔板 μ大號(hào)AssayMedium的,。將對照細(xì)胞與單獨(dú)的測定培養(yǎng)基（無mAb）一起溫育，隨后確定自發(fā)和大⁵¹ Cr釋放,，以及抗體非依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（AICC）,。將PBMC（效應(yīng)子）在分析培養(yǎng)基中，在單獨(dú)的96孔聚丙烯板中連續(xù)稀釋,，產(chǎn)生6.25×10的濃度,。^5個(gè)細(xì)胞/ 100 μ L，3.13x 10 ⁵細(xì)胞/ 100 μ L,，1.56×10個(gè)⁵細(xì)胞/ 100 μ L,，7.81x 10 ⁴細(xì)胞/ 100 μ L，3.91×10個(gè)⁴細(xì)胞/ 100 μ L. 100 μ LPER PBMC懸浮液的孔中轉(zhuǎn)移到變量E：含有T比assayplate ⁵¹ Cr標(biāo)記的KIT225 / K6 + 1 μ克/毫升的mAb,，得到E：的T比50：1,，25：1，12.5：1,，6.25： 1和3.13：1,。到variableantibody濃度測定板，將PBMC稀釋至3.13£106細(xì)胞/ 100 μ Land100 μ每孔加入到試驗(yàn)孔中升,。100 μ將單獨(dú)的Assay培養(yǎng)基中的L（無效應(yīng)物）加入到⁵¹ Cr標(biāo)記的KIT225 / K6C mAb中,，以確定⁵¹ Cr的自發(fā)和大釋放,。Theassay平板在50 RCF離心2分鐘，并在37℃培養(yǎng)^Ô CIN 7.5％CO ₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4個(gè)小時(shí),。4國稅發(fā)小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束前30分鐘,，25體積 μ tothe適當(dāng)?shù)膶φ湛字屑尤隠 8％的TritonX-100的確定的大釋放^51個(gè) Crfrom靶細(xì)胞。ADCC活性的陽性對照抗體是對HLA-DR b鏈具有結(jié)合特異性的人源化IgG1 / k抗體Hu1D10,。

  抑制IL-2依賴性增殖

  使用需要IL-2增殖的人KIT225 / K6細(xì)胞系測定Zenapax和DAC HYP的相對效力,。在微量滴定組織培養(yǎng)板中在IL-2存在下針對單位體積的細(xì)胞滴定抗體，并使用530nm激發(fā)和590nm發(fā)射波長測定Alamarblue的減少,。通過繪制相對熒光單位對log10濃度來確定陽性。產(chǎn)生S形曲線的值,，并使用SoftMax Pro 4.3軟件中的4參數(shù)擬合進(jìn)行評估,。

  

   

   

• 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

   

  ATL的小鼠模型[2]

   

  ATL細(xì)胞群MET-1從患有急性ATL的患者的外周血中建立，并且通過NOD / SCID小鼠中的連續(xù)轉(zhuǎn)移維持細(xì)胞,。MET-1細(xì)胞具有通過熒光激活細(xì)胞分選分析闡明的暗色表型：CD3 ^dim,，CD4 ^{+ /} - ，CD7 ^-,，CD20 ^{- 和} CD25 ⁺,。通過腹膜內(nèi)注射1.5×10 ⁷ MET-1細(xì)胞到NOD / SCID小鼠中建立白血病模型。當(dāng)這些小鼠的血清可溶性IL-2R- α （sIL- 2R- α ）水平超過1000pg / mL時(shí),，對這些小鼠進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn),，這在腫瘤接種后約10至14天發(fā)生。

  大耐受劑量的定義

  在開始治療研究之前,，在NOD / SCID小鼠中測定大耐受劑量的縮酚酸肽,。每天通過腹膜內(nèi)施用每千克體重0.125,0.25,0.5,1.0和2.0mg縮酚酸肽的劑量，持續(xù)2周,。2.0mg / kg組中的所有小鼠在第7天死亡,，并且1.0mg / kg組中80％的小鼠在第14天死亡。在0.5,2.25和0.125mg / kg組中的小鼠在注射縮酚肽后6個(gè)月是stillalive ,。因此,，選擇用于治療試驗(yàn)的劑量為0.5mg / kgevery14天，持續(xù)14天; 這與其他研究人員在小鼠中使用的結(jié)果一致,。

  Therapystudy

  在攜帶MET-1白血病的小鼠中進(jìn)行治療性研究,，在小腫瘤負(fù)荷試驗(yàn)中血清替代腫瘤標(biāo)志物sIL-2R- α 值為1000至10000μg / mL，在大腫瘤負(fù)荷試驗(yàn)中為10000至25000pg / mL ,。在治療試驗(yàn)中有5組,。組1中，縮酚酸肽組,，接收的0.5mg的縮酚酸肽/ kg體重2 weeks.Group 2每隔一天,，免疫治療（達(dá)珠單抗）基團(tuán),，被賦予靜脈injectionsof腹腔注射100 μ 克達(dá)珠單抗在第0，7,，14,，組3，聯(lián)合治療組,，接受縮酚酸和達(dá)利珠單抗的聯(lián)合治療（給藥方案如組1加組2）,。第4組收到 200μ每周一次PBS，持續(xù)4周,，并作為對照,。第5組，沒有腫瘤和沒有治療,，作為NOD / SCID小鼠自然死亡的對照,。在小腫瘤負(fù)荷治療試驗(yàn)中每組有13只小鼠（sIL- 2R - α ，1000-10 000 pg / mL）,，在大腫瘤負(fù)荷中每組有8只小鼠（sIL-2R- α ,，10 000- 25 000 pg / mL）。這些組被隨機(jī)分配并且在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)具有替代腫瘤標(biāo)記物sIL-2R- α的可比較的平均水平,。

  監(jiān)測腫瘤生長

  的血清濃度國稅發(fā)可溶性IL-2R-的測量 α 或可溶性 β 2 -微球蛋白（ β 2 μ ）用酶聯(lián)免疫吸附測定進(jìn)行,。根據(jù)制造商的建議進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定。

  

   

  

   

• 不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依據(jù)體表面積的等效劑量轉(zhuǎn)換表（數(shù)據(jù)來源于FDA指南）

   

   

  動(dòng)物 A (mg/kg) = 動(dòng)物 B (mg/kg)×動(dòng)物 B的Km系數(shù)/動(dòng)物 A的Km系數(shù)

   

  例如,，已知某工具藥用于小鼠的劑量為88 mg/kg , 則用于大鼠的劑量換算方法：將88 mg/kg 乘以小鼠的Km系數(shù)（3）,，再除以大鼠的Km系數(shù)（6），得到該藥物用于大鼠的等效劑量44 mg/kg,。

• 參考文獻(xiàn)

  [1] Ganguly,，B。; Balasa,，B,。; Efros，L,。; 公主Hinton; Hartman,，S。; Thakur,，A,。; 熊，JM; 施密特,，B,。; 羅賓遜，RR; Sornasse,，T,。; Vexler,，V。; Sheridan,，JP,，與Zenapax相比，CD25結(jié)合抗體Daclizumab High-Yield Process具有*的糖基化模式和降低的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性,。MAbs 2016,8（7??）,，1417-1424。
  [2] Chen,，J,。; 張，M,。; Ju,，W。; Waldmann,，TA，使用縮酚肽及其與針對CD25的未修飾的達(dá)珠單抗的組合有效治療成人T細(xì)胞白血病的鼠模型,。Blood 2009,113（6）,，1287-93。

  分子式	分子量	CAS號(hào)	儲(chǔ)存方式 -80 ℃長期儲(chǔ)存,。干冰運(yùn)輸
  溶劑（常溫）	DMSO	水	乙醇

  體內(nèi)溶解度

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