celldatasci使命是使用先進(jìn)的分子分析技術(shù)來挑戰(zhàn)生物樣本,，并加強基礎(chǔ)科學(xué)和個性化醫(yī)療的關(guān)鍵遺傳和基因組數(shù)據(jù)的恢復(fù)。

celldatasci RNAstorm說明書

The RNAstorm™ Kit - Powerful RNA extraction from FFPE samples

RNAstorm™試劑盒 - 從FFPE樣品中提取強大的RNA

福爾馬林固定的組織樣品是RNA提取的挑戰(zhàn),，通常導(dǎo)致可擴增的RNA的低產(chǎn)率和在涉及酶操作的后續(xù)步驟中的差的性能,，包括逆轉(zhuǎn)錄和測序文庫制備,。

RNAstorm™提取試劑盒采用專有的CAT5™技術(shù),，可增強甲醛誘導(dǎo)損傷的去除，并為RNA提供更高的產(chǎn)量和質(zhì)量,，更好的完整性和更高的可擴增性,。該技術(shù)由Cell Data Sciences研究人員開發(fā)，基于斯坦福大學(xué)開展的研究,，并于2015年在Nature Chemistry上發(fā)表,。

無論您是進(jìn)行RNA-seq,，qPCR，微陣列還是其他基因表達(dá)分析,，RNAstorm™試劑盒都是您獲得成功的適合機會,。

一個簡單方便的工作流程

RNAstorm試劑盒為從FFPE樣品中提取高產(chǎn)量和高完整性RNA提供了便利的工作流程。

該試劑盒還可與DNAstorm™試劑盒結(jié)合使用,，從同一組織切片中獲得純DNA和RNA,。

可擴增RNA的產(chǎn)量更高

使用來自各種組織的FFPE樣品的RNAstorm™試劑盒可以看到RNA產(chǎn)量和質(zhì)量的顯著改善（通過可擴增RNA的量來衡量），其年齡范圍從1976年到2015年,。

NormalLiver 1NormalLiver 2NormalKidneyRenal CellCarcinomaColorectalCancer 1ColorectalCancer 20102030Fold increase in RNA amountRNAstorm™ KitKit Q

通過FFPE組織的定量RT-PCR比較RNA回收率,。“Q”代表競爭性商業(yè)FFPE提取試劑盒。

更高完整性RNA

NormalLiver 1NormalLiver 2NormalKidneyRenal CellCarcinomaColorectalCancer 1ColorectalCancer 2020406080DV200 (%)RNAstorm™ KitKit Q

對于使用RNAstorm TM試劑盒提取的RNA相對于流行的商業(yè)試劑盒,，觀察到增加的DV ₂₀₀值,。DV ₂₀₀表示使用Agilent Bioanalyzer RNA 6000納米試劑盒測量的長度大于200nt的RNA的百分比。

使用來自RNAstorm TM試劑盒和試劑盒Q所見的相同樣品的RNA獲得的BioAnalyzer痕跡的示例性疊加顯示如下,。

經(jīng)常問的問題

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA中是否存在任何污染的基因組DNA,？

基因組DNA的污染是一個很大的問題，因為它可以干擾下游應(yīng)用,。RNAstorm™試劑盒包括優(yōu)化的DNase消化步驟,，可去除污染的基因組DNA，而不會顯著影響RNA產(chǎn)量,。雖然此步驟是可選的,，但強烈建議您這樣做。

我可以從FFPE樣本中獲得多少RNA,？

影響獲得的RNA總量的大變量是樣品本身的質(zhì)量（即組織的類型和數(shù)量,，以及分離和保存樣品時的護(hù)理）。使用RNAstorm™試劑盒,，并假設(shè)至少合理的樣品質(zhì)量,，可以獲得大于1微克的量。

使用RNAstorm™試劑盒獲得的RNA可以用于RNA-Seq嗎,？

是,。只要RNA具有足夠高的質(zhì)量，就可以獲得高質(zhì)量的文庫,。對于Illumina測序,，建議使用至少30％的DV200，并且應(yīng)使用提供至少1μgRNA的樣品,。

如何準(zhǔn)備組織,？

使用切片機從FFPE樣品中獲得5-10μm切片,。如果可以可靠地切割，則可以使用厚度小于5μm的部分,。建議不要使用厚度超過10微米的部分,，因為它們可能無法*消化。此外,，每次提取應(yīng)使用不超過5個部分（每個10μM）,。使用過多的組織會導(dǎo)致消化不*并降低產(chǎn)量。

我可以使用非石蠟包埋的組織嗎,？

是的,，可以使用未包埋在石蠟中的組織。在這種情況下,，我們建議機械研磨相當(dāng)于推薦部分?jǐn)?shù)量的組織,。

我可以使用FFPE核心嗎？

是的,，可以使用FFPE核心,。由于核心不使用切片機進(jìn)行處理，因此如果觀察到不*消化,，則推薦樣品消化更加困難并且建議進(jìn)行機械均質(zhì)化（例如使用鋼珠）,。

你推薦哪種脫蠟方法？

RNAstorm™試劑盒包括推薦的Deparaffinization Reagent,。與其他常用方法（例如二甲苯）不同,，脫石蠟試劑是，無毒的,，不需要使用通風(fēng)櫥,。在我們的測試中，所包含的試劑在去除石蠟和允許純化高質(zhì)量核酸方面至少與二甲苯一樣有效,。

定量從FFPE樣品中獲得的RNA的適合方法是什么,？

源自FFPE的RNA比從新鮮樣品獲得的RNA更準(zhǔn)確地定量。僅知道RNA的量是否足夠,，以及RNA是否適用于下游應(yīng)用,，這取決于以下因素：

• 片段大小分布：如果RNA-Seq由<200nt的片段組成，則5μg樣品（通過Qubit測量）對RNA-Seq無用,。
• 化學(xué)修飾：對于從福爾馬林固定的樣品中獲得的RNA,，各種化學(xué)加合物和交聯(lián)（包括堿基修飾，堿基交聯(lián)和堿 - 蛋白質(zhì)交聯(lián)）可使核酸分子不能被酶接近,，因此在下游應(yīng)用中無活性,。
• 污染：純化過程中使用的細(xì)胞碎片,，蛋白質(zhì),，鹽和清潔劑可能會影響下游檢測,。例如，基于UV / Vis的方法如Nanodrop特別容易受到在200-280nm范圍內(nèi)吸收的污染物的影響,。
• 基于熒光的方法如Qubit容易出現(xiàn)明顯錯誤,。使用低濃度的DNA或RNA時，基于染料的檢測可能不是線性的,。還必須注意RNA樣品中基因組DNA的污染,，因為用于熒光定量的染料并不*特異于FFPE衍生的DNA或RNA。
• 定量PCR是定量嚴(yán)重受損和修飾的核酸的優(yōu)選方法,。

RIN編號是否應(yīng)用于確定FFPE衍生RNA的質(zhì)量,？

雖然RIN數(shù)可以提供有關(guān)樣品碎片程度的一般信息，但它不是敏感或可預(yù)測的,，不足以成為下游性能的有用指標(biāo),，特別是對于RNA-Seq。通常,，F(xiàn)FPE衍生的RNA的RIN數(shù)字將在2到3之間,。這些樣本中的一些將用于RNA-Seq，而其他樣本則不會--RIN不會告訴您,。

使用Illumina測序在RNA-Seq中稍微更好的預(yù)測性是DV200,，其代表長于200個核苷酸的RNA片段的百分比。DV200也是基于Bioanalyzer數(shù)據(jù)計算的,，但是存在與所有基于生物分析儀的方法相同的缺點,，特別是高變異性。

從FFPE樣品中提取RNA時我需要知道什么,？

• 避免使用基于有機溶劑的方法（Trizol）
• 避免使用刺激的離液鹽（即胍鹽）
• 避免使用UV和/或Qubit影響下游定量的洗滌劑（例如Triton X-100）
• 不要依賴RIN來定量FFPE衍生樣品的完整性,。看看為什么,。請改用DV200,。
• 使用從福爾馬林中去除化學(xué)修飾的試劑盒或方法。不要將溫度升至80?C或更高,。即使在此溫度下短時間也會顯著降低完整性,。
• 警惕Qubit和Nanodrop濃度，因為有可能被有機分子或DNA污染,。
• 使用qPCR定量RNA,，并始終仔細(xì)查看解鏈曲線，以確定是否可能發(fā)生非特異性擴增,。