ALSTEM是一家位于灣區(qū)的早期生物技術(shù)公司,，擁有快速擴展的產(chǎn)品和服務(wù)組合,，為生物制藥和學(xué)術(shù)機構(gòu)提供服務(wù),。受到加利福尼亞干細胞研究承諾的啟發(fā),，ALSTEM于2012年由具有iPS細胞重編程和基因組編輯技術(shù)專業(yè)知識的科學(xué)家創(chuàng)立,。

ViralBoost Reagent：＃VB100

描述

ViralBoost Reagent（500X）是一種新型的小分子混合物,，可以增強病毒的產(chǎn)生，是一種功能強大,，廣泛適用于有效病毒包裝的試劑,。ViralBoost試劑在轉(zhuǎn)錄水平上穩(wěn)定地調(diào)節(jié)病毒RNA包裝，這可以增加逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蚵《绢w粒的產(chǎn)量高達10倍,。易于使用的協(xié)議使ViralBoost Reagent非常適合各種規(guī)模的病毒包裝。

圖1.來自GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK 293T細胞的流式細胞術(shù)數(shù)據(jù),，其在不存在和存在ViralBoost試劑的情況下包裝,。

圖2.用GFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK 293T細胞，其與ViralBoost一起包裝和不包裝

ViralBoost Reagent是一種新型的小分子混合物,，用于高滴度病毒的生產(chǎn)，是一種功能強大,，廣泛適用于有效病毒包裝的試劑,。它穩(wěn)定地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平上的病毒RNA包裝，這可以大大增加逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蚵《绢w粒的產(chǎn)量,，多可達10倍。易于使用的協(xié)議使ViralBoost Reagent非常適合各種規(guī)模的病毒包裝,。

第1天：轉(zhuǎn)染前一天,，

1.用1x明膠涂布板/盤30分鐘。吸出明膠,，每100mm平板涂3-4~10×10 ⁶ HEK 293T細胞,。每塊板使用10毫升培養(yǎng)基。

注意：良好的單細胞懸浮液（胰蛋白酶消化良好）和均勻分布細胞非常重要,。

第2天：轉(zhuǎn)染

注意：按照制造商的協(xié)議準備轉(zhuǎn)染,。

2.準備兩個試管，并在每個試管中加入0.5 ml DMEM,。在一個試管中,，加入DNA混合物（含有病毒載體和包裝混合物）并通過標記管充分混合。在另一個試管中,，添加NanoFect（目錄號NF100）,。通過標記管混合。

注意：在室溫（20-25°C）下孵育不超過5分鐘,。

3.將NanoFect-DMEM混合物轉(zhuǎn)移到DNA管中,，上下移液2-3次。通過渦旋混合5-10秒充分混合,。

4.在室溫下孵育約15分鐘,，以允許NanoFect / DNA復(fù)合物自組裝。

5.將NanoFect / DNA混合物逐滴添加到板上,，輕輕搖動板并將板放回培養(yǎng)箱中

第3天：更改培養(yǎng)基并添加ViralBoost

6.用10ml新鮮培養(yǎng)基替換上清液,，并補充20μlViralBoost（500X）。將平板放回細胞培養(yǎng)箱中,。

第4天：收集病毒

,！小心小心處理病毒材料并避免溢出。使用漂白劑凈化有害液體（10％終濃度30分鐘）,。

7.將上清液收集在50ml錐形管中并置于冰上,。將上清液以1,000g離心10分鐘以除去細胞碎片,。（將離心機預(yù)設(shè)為4°C）

8.通過0.45μm過濾器過濾上清液。將過濾的上清液轉(zhuǎn)移至無菌容器中,，并向每4體積含病毒的上清液中加入1體積的冷逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒沉淀溶液（4℃,，目錄號VC100和VC200）,。（例如：5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒沉淀溶液,，含20ml病毒上清液）。

9.充分混合并冷藏過夜,。

第5天：濃縮病毒

10.在4℃下以1500g離心混合物30分鐘,。離心后，病毒顆?？赡茉谌萜鞯撞匡@示為米色或白色顆粒,。

11.丟棄上清液。通過以1500g離心5分鐘來旋轉(zhuǎn)殘留溶液,。通過抽吸去除所有的液體痕跡,，小心不要打擾顆粒中沉淀的病毒顆粒。

12.使用冷的無菌PBS或DMEM在4℃下以1/10至1/100的原始體積重懸病毒顆粒,。在低溫小瓶中等分并儲存在-80°C直至準備使用,。

注意：可以使用病毒濃縮/純化程序去除ViralBoost Reagent。當直接用于轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK 293T細胞時,，尚未檢測到具有ViralBoost試劑的粗病毒顆粒對目的基因表達的副作用,，但是從細胞系到細胞系可能是不同的。建議事先測試ViralBoost對靶細胞的影響,。

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