TGIRT™-III Enzyme

規(guī)格：

 10 Reactions (TGIRT10)

50 Reactions (TGIRT50)

5 x 50 µl (TGIRT5x50)

10 x 50 µl (TGIRT10x50)

單位定義：

TGIRT的一個單元® -III逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）活性是酶的使用聚在60℃下聚合1納摩爾的dNTP的在1分鐘（RA）所需要的量/寡（dT）42作為底物。

酶濃度：

200單位/μl

酶儲存緩沖液：

20mM Tris-HCl（pH 7.5）,，500mM KCl，1mM EDTA,，1mM DTT,，50％甘油

酶屬性和新穎活動：

比逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄酶更高的熱穩(wěn)定性，持續(xù)合成能力和保真度,，允許從高度結(jié)構(gòu)化或重度修飾的RNA （例如tRNA）和包含富含GC的重復擴增的RNA合成全長,，端對端cDNA 。1-9,12,15,18

新型端對端模板轉(zhuǎn)換活動,，可在反轉(zhuǎn)錄過程中連接RNA-seq或PCR適配器,，并且無需單獨的RNA 3'-適配器連接步驟。1這種模板轉(zhuǎn)換活性極大地促進了鏈特異性RNA-seq文庫的構(gòu)建,，而且比使用隨機六聚體引物或使用RNA連接酶進行銜接子連接的方法具有更小的偏差,。1,7,8

從退火引物合成cDNA。將退火的引物應具有推測的T 米 > 60的直徑： C.酶與反應底物混合,，在室溫下,，通過加入dNTP的反應開始30分鐘的預溫育，建議,。新應用的zui宜條件應該通過測試25-450mM NaCl的一系列鹽濃度來確定,。

建議用于酶的用途：

1.全面的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組分析。8

2.全細胞,，外泌體,，血漿和其他無細胞RNA的RNA-seq。7,8,15

3.分析miRNA,，tRNA和其他小的非編碼RNA,。1-9,12,15

4. RIP-seq，HITS-CLIP,，irCLIP和CRAC用于表征RNA-蛋白質(zhì)相互作用和核糖體分析,。1,10,11

5.通過高通量測序鑒定RNA堿基修飾,。4,5,13,??14

6.使用諸如SHAPE和DMS修飾的方法進行全基因組或靶向RNA結(jié)構(gòu)作圖。1,16

7.富含GC重復擴增的逆轉(zhuǎn)錄和定量,。18

8.長cDNA的合成,。1

9.RT-qPCR。1

10.單鏈DNA-seq,。17

11.分析FFPE腫瘤樣本（咨詢InGex）,。

酶的優(yōu)點：

1.全面的鏈特異性轉(zhuǎn)錄組分析。

核糖核碎片,，通用人類參考RNA樣品的TGIRT®-seq概括了人類轉(zhuǎn)錄物和穗突起的相對豐度,，與非鏈特異性TruSeq v2相比，并且優(yōu)于鏈特異性Tru-Seq v3,。TGIRT®-seq比TruSeq v3具有更高的鏈特異性,，并消除了TruSeq固有的隨機六聚體引發(fā)的取樣偏差。TGIRT®-seq顯示出更加統(tǒng)一的5'至3'基因覆蓋范圍,，并且比TruSeq識別更多的剪接點,。TGIRT®-seq能夠在與結(jié)構(gòu)化小型ncRNA相同的RNA-seq中同時分析mRNA和lncRNA，包括tRNA,，TruSeq數(shù)據(jù)集基本上不存在tRNA,。8

2.全細胞，外泌體,，血漿和其他細胞外RNA的RNA-seq,。

快速的處理時間（通過PCR步驟對RNA-seq文庫構(gòu)建<5小時）; 需要少量的RNA（低ng范圍）; 包括mRNA和lncRNA以及小ncRNA的全面轉(zhuǎn)錄譜，包括tRNA,，pre-miRNA和其他結(jié)構(gòu)化小型ncRNA的全長讀段; 比常規(guī)方法更少的偏差和更大的鏈特異性,。7,8,15

3.通過TGIRT®模板轉(zhuǎn)換的RNA-seq文庫構(gòu)建，如RIP-seq,，HITS-CLIP,，irCLIP，CRAC,，??核糖體譜分析。

快速的處理時間（通過PCR步驟對RNA-seq文庫構(gòu)建<5小時）; 需要少量的RNA（低ng范圍）; 不需要RNA連接酶,，通過減少步驟中的步驟來減少偏倚并提率,。1,10,11

4.比逆轉(zhuǎn)錄病毒RT更高的熱穩(wěn)定性，持續(xù)合成能力和鏈置換活性,。

使用錨定寡核苷酸（dT）引物,，可以構(gòu)建RNA聚合腺苷酸化的RNA文庫，與沒有ribodepletion步驟的逆轉(zhuǎn)錄病毒RT相比,，具有更均勻的5'至3'覆蓋范圍,。1

通過基于毛細管電泳的方法（如SHAPE或DMS結(jié)構(gòu)圖）進行RNA結(jié)構(gòu)作圖,，其顯著的讀數(shù)長度和更少的提前停止時間比逆轉(zhuǎn)錄病毒RTs更短。1,16

可以分析含有富含GC的重復擴增的RNA模板,。18

能夠合成來自tRNA和其他小型結(jié)構(gòu)化/修飾的ncRNA的全長,，端對端cDNA，這些逆轉(zhuǎn)錄病毒RT難以治療,。4-9,12-15     

5.人血漿和大腸桿菌  基因組DNA的ssDNA-seq ,。

通過直接在DNA鏈的3'末端啟動DNA合成，同時連接DNA-seq接頭而不進行末端修復,，拖尾或連接,，以更簡單的工作流程捕獲的DNA末端。能夠分析核小體定位,，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,，DNA甲基化位點和起源組織。17

參考文獻：

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