上海起發(fā)為InvivoGen國內(nèi)代理商,，美國InvivoGen Invivogen 主要提供抗生素,，轉(zhuǎn)染試劑,，細(xì)胞因子，細(xì)胞系,，質(zhì)粒等產(chǎn)品,。抗生素涵蓋了細(xì)胞培養(yǎng),、篩選全系列,，如Blasticidin S,Hygromycin B , Phleomycin, Primocin,   Zeocin等細(xì)胞分選常用抗生素。尤其以抗細(xì)胞支原體污染的抗生素Plasmocin™zui為出名,，該抗生素因其性能受到客戶*,。

品牌：Invivogen

貨號：pcpgf-bas

品名：pCpGfree-basic with mSEAP reporter gene  帶有mSEAP報道基因的pCpGfree-basic

規(guī)格：20 µg

pCpGfree-basic是*不含CpG二核苷酸的報道質(zhì)粒。這些質(zhì)粒缺乏完整的啟動子區(qū)域（與pCpGfree質(zhì)粒相比）,。

pCpGfree-堿性質(zhì)粒在mSEAP或Lucia（一種分泌型熒光素酶報告基因）上游含有多克隆位點(diǎn)（MCS）,。報道基因在用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的表達(dá)取決于在報道基因上游插入功能性啟動子或增強(qiáng)子/啟動子盒。

因此,，pCpGfree堿性質(zhì)粒允許單獨(dú)研究CpG甲基化對啟動子的影響，或與增強(qiáng)子元件組合,。

產(chǎn)品規(guī)格

•不含CpG的質(zhì)粒骨架

•不含增強(qiáng)子/啟動子區(qū)域的報告質(zhì)粒：

   - 鼠分泌的堿性磷酸酶（SEAP）

   - 分泌型熒光素酶（Lucia）

•可在含Zeocin™的大腸桿菌中選擇

本產(chǎn)品受限制使用許可（請參閱條款和條件）,。

內(nèi)容

•提供20μg作為凍干DNA的pCpGfree-堿性質(zhì)粒

•將大腸桿菌 GT115菌株凍干在紙盤上

•4袋大腸桿菌 Fast- Media®Zeo（2 TB和2瓊脂）

描述

質(zhì)粒特征

在大腸桿菌中復(fù)制和選擇質(zhì)粒所需的所有元件和哺乳動物細(xì)胞中的基因表達(dá)*沒有CpG二核苷酸。此外,，所有Dam甲基化位點(diǎn)（GATC）已被去除以防止原核甲基化,。

用于在大腸桿菌中表達(dá)的元件

•復(fù)制起點(diǎn)：大腸桿菌 R6K gamma ori已被修飾以去除所有CpG。該起源由pir基因編碼的R6K特異性啟動子蛋白π激活[1],。

•細(xì)菌啟動子：EM2K是細(xì)菌EM7啟動子的無CpG版本,。

•選擇標(biāo)記：Zeocin™抗性基因是一個含有大量CpG二核苷酸的小基因（<400 bp）。一個合成的新等位基因被創(chuàng)建,，不含CpGs,。

用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的元件

•合成的mSEAPΔCpG基因：通過化學(xué)合成構(gòu)建的鼠SEAP基因的無CpG等位基因。

•聚腺苷酸化信號：聚腺苷酸化信號是晚期SV40聚腺苷酸化信號的無CpG形式,。

MAR：基質(zhì)連接區(qū)域（MAR）是典型的富含AT的序列,，能夠在獨(dú)立調(diào)控的結(jié)構(gòu)域之間形成屏障[2]。pCpGfree質(zhì)粒含有來自人IFN-β基因或β珠蛋白基因的5'區(qū)域的兩個MAR,，因?yàn)樗鼈兲烊徊缓珻pG,，所以被選擇,。MARs被放置在細(xì)菌和哺乳動物轉(zhuǎn)錄單位之間。

•MCS：多克隆位點(diǎn)包含幾個常用的限制性位點(diǎn),，以方便克隆感興趣的基因,。5'Sda I，Bsp 120I,，Avr II,，Nsi I，Ppu 10I,，Sca I,，Bam HI，Spe I 3'

由于存在R6Kγ復(fù)制起點(diǎn),，pCpGfree-basic只能在表達(dá)pir突變基因的大腸桿菌突變株中擴(kuò)增,。它不會在標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株中復(fù)制。因此,，pCpGfree-basic與大腸桿菌 GT115菌株一起提供,，該菌株也是Dcm甲基化缺陷的pir突變體。

1. Wu F.等人 1995.對R6Kγ-起源核心復(fù)制子賦予穩(wěn)定維持的DNA片段,。J Bacteriol,。177（22）：6338-45。

2. Bode J.等,，1996,。支架/基質(zhì)附著區(qū)：具有多種調(diào)節(jié)功能的拓?fù)溟_關(guān)。Crit Rev Eukaryot Gene Expr,。圖6（2-3）：115-38,。

細(xì)節(jié)

基于pCpGfree的骨干

MCS： 5'-SdaI，Bsp120I,，AvrII,，NsiI，Ppu10I,，ScaI,，BamHI，SpeI,，HindIII-3'

程序

1-將啟動子和/或增強(qiáng)子片段插入pCpGfree-basic

2-用CpG甲基化酶（Sss I）或位點(diǎn)特異性甲基化酶（Hha I,，Hpa II）處理重組質(zhì)粒。

3-用甲基化酶處理或未處理的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。

4-通過使用適當(dāng)?shù)臋z測試劑確定報告子表達(dá)來分析啟動子CpG甲基化,。

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