背景介紹
在藥物疫苗生產(chǎn)中,,需要對起始、中間和最終產(chǎn)品的抗原水平進(jìn)行控制,。用以檢測衰減或失活的病毒或細(xì)菌數(shù)量,。由于這些抗原通常由蛋白質(zhì)組成,總蛋白的分析定量是一種可選方法,。
《藥典》規(guī)定了許多相關(guān)方法,,其中包括幾種紫外/可見分光光度法(如Lowry法、Bradford法,、BCA法)以及兩種總氮法,,即凱氏定氮法和催化燃燒法。本應(yīng)用說明重點介紹了歐洲藥典Pharm. Eur. 2.5.33, Method 7 B催化燃燒法:氮化合物在氧氣中高溫裂解為一氧化氮(NO),,然后通過化學(xué)發(fā)光檢測器(CLD)進(jìn)行檢測,。此方法描述幾乎與EN 12260一致,后者描述了環(huán)境水中TNb的測定,。 multi N/C分析儀既是如此設(shè)計,,因此也可用于醫(yī)藥產(chǎn)品中TNb的測定。TNb可以轉(zhuǎn)化為總蛋白來確定其抗原的水平,。
由于蛋白質(zhì)的含氮量不同,,根據(jù)以下公式乘以系數(shù)6.25,將總氮濃度轉(zhuǎn)換為總蛋白質(zhì)濃度已被廣泛接受:
C [總蛋白] = c [TN] x 6.25
儀器
表1: 分析儀說明:multi N/C 2100S
樣品和試劑
在客戶現(xiàn)場制備的5個尿素TNb校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn),、1個BSA對照標(biāo)準(zhǔn)品和3個未知的客戶樣品,,測定三次。分析前,,樣品在4℃下制冷劑中保存,。
恢復(fù)至室溫室后,用微量移液管將液體樣品直接轉(zhuǎn)移到2毫升樣品瓶中,,并蓋上瓶蓋,。由自動進(jìn)樣器取樣75μL樣品直接注射進(jìn)燃燒爐中。在鉑催化劑的作用下,所有氮化合物在純氧環(huán)境中通過高溫燃燒催化轉(zhuǎn)化為一氧化氮(NO),,隨后由化學(xué)發(fā)光檢測器(CLD)定量檢測NO,。
測樣順序、自動攪拌及洗針設(shè)置均由AS60自動進(jìn)樣器控制完成,。
校正
采用BSA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配置5 – 60 mg/L系列總氮(TNb)多點校準(zhǔn)標(biāo)樣,。200mg TN/L BSA儲備溶液(Sigma Art.Nr. A-7906,白蛋白,,牛氮含量為15.60%,,純度為98%),稱重128.2mg,,用超純水定容至100mL,。此類樣品中從測定的氮含量計算蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換因子(在文獻(xiàn)中找到)為6.25。
校正曲線
圖1:TN示例 – BSA校正曲線和特征范圍5-60mg/L N
結(jié)果和討論
每個樣品至少測定三次,。
結(jié)論
所有樣品都得到了很好的重復(fù)性,,RSD值很低。
采用微量注射器進(jìn)樣,,從樣品瓶到燃燒爐的距離短,,直接注射無傳輸管路和閥門。樣品消耗量極少,,3次潤洗,,5次75μL重復(fù)測試,樣品消耗總體積不超過1.5mL,。
配置CLD檢測器的multi N/C分析儀是進(jìn)行總氮測定的最佳分析系統(tǒng),遵循Pharma Eur. 2.5.22 method 7 B,??蛻舻男?zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和檢查標(biāo)準(zhǔn)(BSA)的回收率佳,樣品峰型多次測量均無偏移重復(fù)性好,,且無拖尾,,充分證明了儀器性能。
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