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相差顯微鏡的使用方法

（一）光源

    相差顯微鏡觀察的光源要滿(mǎn)足三個(gè)zui基本條件:*，為較強(qiáng)的光x,。因?yàn)樵谙嗖铒@

微鏡中環(huán)狀光欄限制了相當(dāng)數(shù)量的光能進(jìn)入成像光路,。位相板還要吸收掉直射光的60-90。庫(kù)列照明方法是滿(mǎn)足這一條件的zui有效措施,。第二,，必須吸收掉光源的熱輻射線(xiàn)。因?yàn)橄嗖铒@微鏡下觀察的對(duì)象中主要是生活狀態(tài)下的活細(xì)胞,。在光路上設(shè)置除熱撼光片或吸熱水層可以滿(mǎn)足去熱條件,。第三，單色光光源能夠保證正確調(diào)整生物標(biāo)本的折射率差異.在光源前附加綠色濾光片足以解決這一條件.

    圖10-26展示庫(kù)列照明方法的光路,。
奧林巴斯顯微鏡

    庫(kù)列照明方法的*步,，要放置標(biāo)本，調(diào)好焦距,。其次確定光源的位里,。使用傳統(tǒng)顯微鏡時(shí).要把照明燈放置在適當(dāng)?shù)木嚯x上，使光源會(huì)聚鏡的焦面對(duì)在孔徑光欄的平面上,。具體操作是:在孔徑光欄上放置磨砂玻片,。當(dāng)照明燈的位置適當(dāng)時(shí)，在磨砂玻片上看到燈絲的影像,。當(dāng)使用內(nèi)裝光源的顯微鏡時(shí),，燈光的距離只能用會(huì)聚鏡的位置加以調(diào)整。其次調(diào)整孔徑光欄的孔徑,。為此目的,，首先縮小孔徑光欄，其次拔掉目鏡,，利用對(duì)焦望遠(yuǎn)目鏡逐漸開(kāi)大孔徑光欄,，使其邊緣適與物鏡口徑相對(duì)應(yīng).這兩步操作完成后即可使用顯微鏡。庫(kù)列照明法的zui重要優(yōu)點(diǎn)是照明光線(xiàn)充足均勻,，并消除散射光的干擾,。

（二）標(biāo)本

    相差顯微鏡觀察的標(biāo)本基本上是未染色生物標(biāo)本，或生活狀態(tài)下的生物標(biāo)本,。觀察這類(lèi)標(biāo)本時(shí)培養(yǎng)瓶壁,、載玻片、蓋玻片等一切插入光路的物體的厚薄要均勻,，介面要平整,，否則致使光路崎變，抵消標(biāo)本細(xì)節(jié)的位相差即光程差,。

（三）校對(duì)光欄和相板的共轆面

    前節(jié)已述及環(huán)狀光欄與位相板的共扼關(guān)系,。相差顯徽鏡的使用方法中zui關(guān)鍵性操作

就是使環(huán)狀光欄的亮環(huán)與位相板的共扼面（暗環(huán)）相對(duì)準(zhǔn)。絕不能相互偏離,，也不能大小不一,。如果校對(duì)不準(zhǔn)確.要泄漏育射光，破壞相差效果,。

    為了校對(duì)共扼面,，首先作到光源照明正確，放置標(biāo)本,，調(diào)好物鏡焦距,，而后拔掉目鏡,，換插校正望遠(yuǎn)舊鏡.將望遠(yuǎn)目鏡的接目透鏡筒（內(nèi)層管）向外抽出。抽到能看清環(huán)狀光欄的亮環(huán)和位相板的暗環(huán)為止,。用固定螺旋把接目鏡鏡筒固定在此位置上,，邊觀察邊調(diào)準(zhǔn)共扼面。如果看到像圖10-27A所示環(huán)狀光欄的亮環(huán)大于位相板的暗環(huán),，或像B所示前者小于后者時(shí),，要用聚光鏡的升降來(lái)調(diào)整大小。當(dāng)看到D所示二者偏移時(shí),，用環(huán)狀光欄合軸調(diào)節(jié)螺旋調(diào)到光路中心一旦出現(xiàn)C所示的情況,，即視野半邊亮另半邊暗時(shí)，調(diào)光源光軸.共扼面的正確調(diào)整以圖10-27E為準(zhǔn).有時(shí)出現(xiàn)多層亮環(huán),、暗環(huán),、圈套圈的情景。這就考慮環(huán)狀光欄是否處于聚光鏡的前焦面上,，光源的距離是否合適等同題.校準(zhǔn)之后拔掉校正望遠(yuǎn)目鏡,，安放原來(lái)的目鏡，進(jìn)行觀察.

（四）正確選用位相板,，位相板的種類(lèi)與功能已在前節(jié)中介紹,。有些文獻(xiàn)中往往用略號(hào)按指某種位相板。例如PM全文是positive medium,，即暗反差（正反差）吸光率中度位相板,。NH的全文是negative high，即明反差（負(fù)反差）吸光率高,。DL=dark low,暗反差低吸收率,，BM二bright medium，明反差中度吸收率,。位相差觀察時(shí)在什么樣條件下應(yīng)該用什么種類(lèi)的位相板間題,，無(wú)法作出定論。因?yàn)闃?biāo)本的各種細(xì)節(jié)的折射率各不相同,。情況變化復(fù)雜,，無(wú)法固定一些條件。但是大體上可以說(shuō)標(biāo)本細(xì)節(jié)與介質(zhì)間反差顯著時(shí),，可用低吸收率位相板,，而反差小時(shí)，用高吸收率位相板.物體形體大時(shí)用低相板,，而物體過(guò)小時(shí)用高相板,。一般用慣明視顯徽鏡的觀察者，使用暗反差相板會(huì)感到滿(mǎn)意（見(jiàn)圖10-25）,。使用位相板的例子可引用水平敏知（1954）的表,。

    當(dāng)選擇位相板時(shí),，預(yù)先側(cè)定標(biāo)本的折光率，由此可以推斷其光程差.測(cè)定折光率的zui簡(jiǎn)便的方法是由貝克,、泰勒創(chuàng)制的,，這方法叫貝克線(xiàn)。就是在顯徽鏡下放大率500 X時(shí),，觀察一個(gè)細(xì)胞或物體邊緣.當(dāng)鏡筒向下移動(dòng)時(shí),，細(xì)胞邊緣的明亮的暈紋移向折射率低的介質(zhì),。鏡簡(jiǎn)上升時(shí)沿細(xì)胞膜邊緣的紋向折射率高的細(xì)胞內(nèi)部移動(dòng).這種關(guān)系用下表展示,。

   上表只能提供標(biāo)本和介質(zhì)的折射率的差異。泰勒（Thaler,1930,1931）提出測(cè)定折射率的方法.這方法是:在顯微鏡放大500 X時(shí),，將被檢標(biāo)本浸于已知折射率的介質(zhì)內(nèi),。顯徽鏡鏡筒提升時(shí)，貝克線(xiàn)移向折射率高的方向,。鏡筒下降時(shí)移向相反方向,。折射率相等時(shí)貝克線(xiàn)消失。已知介質(zhì)的折射率如下,。