您好, 歡迎來(lái)到化工儀器網(wǎng)
【收藏】一文讀懂熒光定量PCR儀
要說(shuō)2020年熱門(mén)研究領(lǐng)及檢測(cè)技術(shù),，非熒光定量PC莫屬,。僅2020上半年，公開(kāi)采購(gòu)PCR基因擴(kuò)增儀機(jī)構(gòu)數(shù)就是去年同期的2.5倍左右,。今天,，小析姐就和大家聊一聊常PCR的原理及相關(guān)技術(shù)，希望能對(duì)你的工作有所幫助,。
PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),，又稱(chēng)體外DNA擴(kuò)增技術(shù),，在1985年由美國(guó)Cetus公司的Kary Mullis，可以將微量目的DNA擴(kuò)增一百萬(wàn)倍以上,。Kary Mullis本人因此獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),。
熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè),后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。
一、熒光定量PCR原理
以探針?lè)晒舛?/font>PCR為例：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,，該探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán),。開(kāi)始時(shí)，探針完整地結(jié)合在DNA任意一條單鏈上,，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,，檢測(cè)不到熒光信號(hào)；PCR擴(kuò)增時(shí),，Taq酶將探針酶切降解,，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。
傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí),，擴(kuò)增反應(yīng)后需要進(jìn)行染色處理及電泳分離，并且只能作定性分析,，不能準(zhǔn)確定量,，易造成污染出現(xiàn)假陽(yáng)性，使其應(yīng)用受到限制,。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)模板的定量,，且具有靈敏度高、特異性和可靠性更好,、自動(dòng)化程度高和無(wú)污染的特點(diǎn),，使得熒光定量PCR逐漸取代常規(guī)PCR。
在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的初數(shù)個(gè)循環(huán)里,，熒光信號(hào)變化不大,，接近一條直線(xiàn)，這樣的直線(xiàn)即是基線(xiàn),，這條線(xiàn)是可以自動(dòng)生成也可以手動(dòng)設(shè)置的,。之后反應(yīng)會(huì)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，這個(gè)期間擴(kuò)增曲線(xiàn)具有高度重復(fù)性,，在該期間,，可設(shè)定一條熒光閾值線(xiàn),，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般會(huì)將熒光閾值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10 倍,。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱(chēng)為CT值,，這個(gè)值與起始濃度的對(duì)數(shù)成線(xiàn)性關(guān)系，且該值具有重現(xiàn)性,。
Ct值大的意義就是用來(lái)計(jì)算目的基因的表達(dá)量,，此時(shí)就有兩個(gè)概念容易被提及,，那就是定量和相對(duì)定量,，定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù),。相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例,，而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。
Ct值誠(chéng)然可以被利用來(lái)計(jì)算這兩種定量結(jié)果,，但是定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品,，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。相對(duì)定量可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，也可以不做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),。標(biāo)準(zhǔn)品制作困難難以獲取，實(shí)驗(yàn)室基本都是選擇相對(duì)定量的方法來(lái)計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量,。