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技術(shù)文章
DNA甲基化檢測科研實驗技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：76 發(fā)布時間：2024-9-24
應(yīng)用簡介
DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制,，DNA甲基化檢測是指利用各種方法對腫瘤細(xì)胞DNA甲基化程度進(jìn)行測定。在惡性腫瘤的發(fā)展中,，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變,，腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系,，DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義,。
技術(shù)原理
DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制，DNA甲基化檢測是指利用各種方法對腫瘤細(xì)胞DNA甲基化程度進(jìn)行測定,。在惡性腫瘤的發(fā)展中,，甲基化的狀態(tài)并不是一成不變，腫瘤細(xì)胞內(nèi)全基因組的低甲基化程度與疾病進(jìn)展,、腫瘤大小和惡性程度都有密切的關(guān)系,，DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
甲基化特異性的PCR（Methylation-specificPCR,，MSP）
Herman等（1996）在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法,。該方法敏感性高，主要用于作定性研究,。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變,；隨后設(shè)計針對甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR,。通過電泳檢測MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段,，則說明該位點(diǎn)存在甲基化,；反之，說明被檢測的位點(diǎn)不存在甲基化,。
特點(diǎn)：適用范圍廣,，能夠檢測特異位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化。
亞硫酸氫鹽測序法（BisulfitesequencingPCR,，BSP）
亞硫酸氫鹽修飾后測序法（BSP）Frommer等（1992）提出的研究DNA甲基化方法,，此方法可靠性及精確度高，能明確目的片段中每一個CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),。用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA,，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變,。隨后設(shè)計BSP引物進(jìn)行PCR,，在擴(kuò)增過程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，最后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化,，稱為BSP-直接測序法,。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測序,，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法,。
特點(diǎn)：精確度高,，能夠準(zhǔn)確檢測出甲基化的程度百分比。
實驗方法
怎樣確定基因的目標(biāo)區(qū)域來進(jìn)行甲基化分析呢,？
轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的CpG島進(jìn)行DNA甲基化分析的shuo選區(qū)域,，一般位于啟動子或者5‘UTR區(qū)。
為什么文獻(xiàn)報導(dǎo)的甲基化序列不在CpG島中,？
沒有明顯的CpG島不代表就沒有甲基化,，甲基化也可能發(fā)生在并不密集的CG區(qū)域。
BSP甲基化擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物可否直接測序,，為什么需要構(gòu)建TA克隆后測序,？
如果進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序就有可能在原有的C位點(diǎn)得到雙峰圖，無法確定甲基化的程度,。