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應用簡介

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的zui普遍的方法,，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤,，實時在線監(jiān)控反應過程,，結(jié)合相應的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度,。目前主要使用Sybrgreen和taqman法對RNA含量進行檢測,。
技術(shù)原理

1、SYBRGREENI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料,。當它與DNA雙鏈結(jié)合時,，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時,，熒光信號急劇減弱,。因此，在一個體系內(nèi),，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量,。SYBRGreen熒光染料定量PCR的基本過程是：1、開始反應,，當SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光,。2、DNA變性時,，SYBRGreen染料釋放出來,，熒光急劇減少。3,、在聚合延伸過程中,，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4,、聚合完成后,，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大,。

2,、TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA,，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團,，3’端偶聯(lián)淬滅基團,，游離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發(fā)光基團發(fā)出的熒光會被淬滅基團吸收淬滅,，探針被水解,，發(fā)光基團和淬滅基團遠離就可以檢測到熒光信號。反應開始時,，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈,，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火,，引物隨后退火到模板上,，之后進行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性,，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針,，發(fā)光基團會跟淬滅基團分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號,，每擴增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的,。

TaqMan探針法的特異性除了由引物提供,，更由探針分子保證，因其退火溫度更高,，所以TaqMan探針法特異性更好,，在一個反應體系中加入多條探針，可以做多個基因同時檢測,。
實驗方法
TaqMan探針法

技術(shù)總結(jié)

一,、引物設(shè)計

1、序列選取應在基因的保守區(qū)段,；

2,、Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp-150bp；

3,、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu),。避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；

4,、典型的引物18到24個核苷長,。引物需要足夠長，保證序列du特性,，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性,。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交,，降低了特異性,，而且比短序列雜交慢,，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃,，GC含量在40%-60%,；

5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C,；

6,、引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基；

7,、為避免基因組的擴增,，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；

8,、探針位置盡可能地靠近上游引物,；

9、探針的5'端應避免使用堿基G,，引物的3’端避免使用堿基A,。探針長度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C,通常比引物Tm高5~10°C,，GC含量在40%~70%,；

10、整條探針中,，堿基C的含量要明顯高于G的含量,；

11、為確保引物探針的特異性,，最好將設(shè)計好的序列在Blast中核實一次,，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針,。

二,、熱啟動

熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一,。 

三,、鎂離子濃度

鎂離子影響PCR的多個方面，如：對DNA聚合酶的活性的影響進而影響產(chǎn)量;對引物退火的影響,，進而影響特異性,。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量,。

四,、模板質(zhì)量

模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會抑制PCR。

五,、防止殘余污染

1,、PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù),。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增,。當前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應時，會發(fā)生共同來源的污染,。這稱之為殘余污染,。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源(非殘余污染)。

2,、可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染,。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準備新反應前更換手套,?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫φ諜z測污染,。使用預先混合的反應成份,，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。