雙氰胺極性較強,，易溶于水，中性及酸性條件下易電離，適合使用默克密理博的兩性離子型親水作用（ZIC®-HILIC）色譜柱分離,。FDA 在Bulletin 4487中采用ZIC®-HILIC色譜柱,，建立了測定乳品,、蛋白質(zhì)等基質(zhì)的樣品中包括雙氰胺在內(nèi)的LC-MS/MS測試方法,，現(xiàn)把該方法樣品處理及檢測條件簡要列出。
 
同時默克密理博致力于分析方法的開發(fā),，為客戶提供簡便,、快速的解決方案，我們采用ZIC®-HILIC 色譜柱在HPLC-UV條件進行了摸索,，為客戶提供快速簡便的測試方法,。
 
默克密理博雙氰胺檢測柱

應用	規(guī)格描述	貨號
HPLC	ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK HPLC Column 250 x 4.6 mm	1.50458.0001
LC-MS/MS	ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm	1.50454.0001

 
LC-MS/MS檢測嬰幼兒奶粉中雙氰胺（FDA Bulletin 4487）
 
FDA #4487方法^[1]中建立了同時檢測奶粉及高蛋白產(chǎn)品中可能存在添加的六種含氮物質(zhì)（環(huán)丙氨嗪、雙氰胺,、尿素,、縮二脲,、三縮脲,、脲基甲脒）分析方法,。方法中采用2%的甲酸水溶液提取，再加入乙腈進行蛋白沉淀,。提取物使用默克密理博的ZIC®-HILIC色譜柱在液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）儀器上分析,，在脫脂奶粉、奶粉,、大豆蛋白,、面粉、麥麩和谷物基質(zhì)中進行標樣添加測試并進行了方法驗證,，該方法測試雙氰胺 Dicyandiamide （DCD）的平均回收率為 98.1% ,，RSD=5.6%，在脫脂奶粉中測試的檢測限（LOD）為20ppb,，定量限為60ppb.
 
 

LC-MS樣品處理方法^[1-2]

1.稱取一定量的奶粉,，加10倍溫水溶解，得奶粉母液樣品,。稱取奶粉母液樣品（2.0±0.02g）于50ml PP管中,，方法空白樣品量取2.0ml水；
2.方法摸索的樣品可在PP管中加入相當于1ppm的雙氰胺對照品,；.校準曲線用的樣品可在樣品管中分別添加相當于0.8-8.0ppm的雙氰胺對照品,；
3.每根PP管中加入18mL 2%的甲酸水溶液，振搖60秒,，使所有固型物分散開,。為了方便快速移取溶液，可設(shè)置5.0mL的移液器量程到4.5mL,，連續(xù)移取4次即得18mL,。加入提取液的PP管超聲30分鐘，再振搖1分鐘,，放入離心機中離心20分鐘（4500rpm）,。
4.移取離心后的上清液50ul，于1.5ml離心管中,，加入950ul乙腈,。在加入乙腈后，會有白色沉淀,，可適當振搖30秒,，再放入離心機中離心10分鐘。離心后,，吸取上清液,，用0.20um PTFE膜過濾至2ml自動進樣瓶中。必要時可取濾液100ul,，加入500ul的乙腈-2%甲酸水溶液（95/5）稀釋后再進行測試,。
 
 

測試條件

色譜條件
色譜柱：ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm（貨號:1.50454.0001）
流動相：A: 95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸銨）
B: 50:50乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM甲酸銨）
流動相比例：0-5min,，100%A.
注:由于雙氰胺保留時間在3.4min左右，可在5分鐘內(nèi)完成分析,。無需運行文獻[2]的梯度程序,。必要時，采用100%的B相機進行色譜柱的沖洗,。
進樣量：2-5ul（FDA方法中采用20ul）
質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源,；掃描方式：正離子掃；檢測方式：多反應檢測（MRM）,；去簇電壓:36V,；雙氰胺的分子離子[M+1]+ m/z:85.0,子離子m/z:68.0,43.1.
 

FDA方法測試結(jié)果

雙氰胺的保留時間tR=3.4min. 檢測限LOD=20ppm，定量限LOQ=60ppb,加標回收率在93-101%,，低,、高兩個濃度下的RSD值分別為5.9%和5.3%.

我們采用LC-MS的色譜柱（ZIC®-HILIC （5 µm, 200Å） PEEK 150x2.1 mm）在Agilent1260 HPLC上進行測試，218nm下的色譜圖如下：


雙氰胺保留時間3.1.3min,，其中藍色-奶粉樣品,；綠色-奶粉加標；紅色-雙氰胺對照品（1.25ug/ml）,。流動相：95:5 乙腈:0.1%甲酸水溶液（含10mM乙酸銨）,，進樣量均為2ul.
 

HPLC方法檢測嬰幼兒奶粉中雙氰胺

為了方便HPLC的用戶，我們采用ZIC®-HILIC HPLC色譜柱開發(fā)了相應的檢測方法,。

樣品前處理
取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中,，加18mL 2%的甲酸水溶液（2.2.4），加蓋密閉,。搖振60秒,，再超聲30分鐘，取出,，再搖振60秒,，放入離心機中離心（4000轉(zhuǎn)），20分鐘,。取出,，吸取上清液50ul，于10ml PP管中,，加入950ul乙腈,，加蓋密閉，振搖60秒,，吸取溶液,，過濾，即得供試液。
或取嬰幼兒配方奶粉2g于50mL PP管中,，加20mL 乙腈-甲酸水溶液（2.2.4）,，加蓋密閉。搖振60秒,，再超聲30分鐘,，取出,，再搖振60秒,，靜置，吸取上層溶液,，過濾,，即得供試液。（快速處理方法）
加標樣品同法配制,。樣品配置方法亦可采用LC-MS/MS的處理方法,。

色譜條件
流動相 （v/v）: A-醋酸銨溶液（10 mM）,B-乙腈
比例*：A:B=12：88（必要時在方法中設(shè)置沖柱程序）
流速:1 mL/min
進樣量：20ul

測試結(jié)果

 

圖中藍色為標樣（1.25ug/ml）,綠色為奶粉空白，紅色為奶粉加標（加入量10ug/g）.

采用ZIC®-HILIC色譜柱,，HPLC-UV下測試,，無干擾，可用于雙氰胺的快速檢測,。該方法處理方法簡單,，色譜峰型良好，方法重現(xiàn)性良好（RSD<3%）,檢測濃度在0.5-10ug/ml之間現(xiàn)行關(guān)系良好（R=0.999）,加樣回收率在95.6-101.5%之間,。按照方法1的處理,，LOD為1.3ug/g奶粉，按照方法2處理,LOD可達0.07ug/g,。

詳細方法可參考：

[1] FDA Laboratory Information Bulletin 4487（雙氰胺檢測方法）
[2]Journal of Chromatography A 1220 （2012） 101–107
[3]FDA Laboratory Information Bulletin 4421（三聚氰胺檢測方法）

其他相關(guān)詳細方法,，請默克密理博。

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