一． PCR的發(fā)展歷史

PCR技術(shù)自問世以來,，在遺傳病,、病原體、癌基因等分子診斷領(lǐng)域和法醫(yī)鑒定等方面發(fā)揮了巨大作用,。代 PCR在進(jìn)行擴增后通過凝膠電泳進(jìn)行定性分析,。

隨著生物分子熒光技術(shù)的發(fā)展，1992年實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應(yīng)運而生,。qPCR是一種在DNA擴增反應(yīng)中,，以熒光化學(xué)物質(zhì)熒光強度來測定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法,。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,，所以Ct值也就成為定量的依據(jù)?；跓晒馓结樆蛉玖系牡诙?PCR 技術(shù)隨后逐漸發(fā)展為檢測核酸目標(biāo)片段的主流分子診斷學(xué)技術(shù),。

在實時定量 PCR（qPCR） 過程中，熒光信號隨著擴增產(chǎn)物的積累而增強,。qPCR 能夠?qū)崟r獲得模板擴增的熒光值,，然后根據(jù)DNA 模板在指數(shù)增長時期的 Ct 值與標(biāo)準(zhǔn) DNA 的Ct值比較來計算初始模板的濃度。但是這種方法由于是大體積反應(yīng)系統(tǒng),，非特異性的擴增增加了假陽性結(jié)果和背景信號,，因此，終無法獲得定量的結(jié)果,。

隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術(shù)的不斷發(fā)展,，新一代PCR技術(shù)，數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現(xiàn),。digital PCR是一種新的定量PCR,，主要是對PCR反應(yīng)物進(jìn)行有限稀釋，隨后在不同的反應(yīng)腔室里進(jìn)行PCR擴增,，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度的技術(shù),。

圖1. PCR技術(shù)的發(fā)展歷程

二． 數(shù)字微流控（dPCR）的原理

20 世紀(jì)末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR,，dPCR) 的概念,，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元,，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ,，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,。

dPCR是一種核酸分子定量技術(shù),。

dPCR一般包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴增和熒光定量分析,。

在PCR 擴增階段,，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平,，并平均分配到幾萬個反應(yīng)腔室里反應(yīng),。這樣子相當(dāng)于變相的對靶基因進(jìn)行富集。與此同時,，由于對原樣品的大幅度的稀釋,，使得PCR抑制劑濃度顯著降低,，這樣dPCR對初始PCR反應(yīng)物里抑制劑的要求顯著低于qPCR。

不同于 qPCR對每個循環(huán)進(jìn)行實時熒光測定的方法,，dPCR 技術(shù)是在擴增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集,，后根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

圖2. dPCR基本原理

三. dPCR與qPCR的對比

相對于熒光定量PCR（qPCR）而言,，dPCR具備以下優(yōu)勢：

1,、 靈敏度可達(dá)單個核酸分子：檢測限低至0.001%，原因在于dPCR可以實現(xiàn)靶標(biāo)DNA/RNA的富集,；

圖3. dPCR可以實現(xiàn)痕量核酸的高靈敏檢測

2,、 無需標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)曲線），即可對靶分子起始量進(jìn)行定量,；

3,、 特別適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測：終點PCR檢測，不依賴Ct值,，不依賴擴增效率,，能克服PCR抑制劑的影響，適合動血樣,、FFPE組織,、糞便、尿液,、痰液,、水樣、土壤,、植物等復(fù)雜樣品中DNA的定量,；

4、 能夠有效區(qū)分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準(zhǔn)確度,、精密度和重復(fù)性,，可以用于測定靶基因的相對表達(dá)，基因拷貝數(shù)變異分析等,。