開展 PCR 應(yīng)具有一定的條件,。需要一個(gè)正規(guī)的 pCR 實(shí)驗(yàn)室，采集標(biāo)本,、核酸提取,、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析應(yīng)在不同的房間進(jìn)行；需有嚴(yán)密的防污染措施,、假陽性和假陰性結(jié)果的質(zhì)控等,。實(shí)驗(yàn)者應(yīng)具有一定的分子生物學(xué)理論知識(shí)及實(shí)驗(yàn)技能，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)和糾正實(shí)驗(yàn)中的問題,。目前,，我國在 PCR 應(yīng)用中尤其是在臨床診斷中存在問題較多，主要表現(xiàn)為： PCR 試劑的考核,、審查工作薄弱,，許多單位實(shí)驗(yàn)條件不符合要求，部分操作人員的理論和實(shí)驗(yàn)知識(shí)水平較低,。 PCR 的應(yīng)用范圍過寬等,，因此造成 PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性差，出現(xiàn)較多的假陽性,、假陰性結(jié)果,。
一、假陽性：
　　實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對(duì)照可提示有無假陽性結(jié)果出現(xiàn),。如果一次實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)陰性對(duì)照中出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)陽性結(jié)果,，提示本次實(shí)驗(yàn)中其它標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果可能有假陽性。造成假陽性的原因包括樣品污染,、擴(kuò)增試劑污染,、擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染等。常見的污染來源包括實(shí)驗(yàn)室環(huán)境,、加樣器,、操作中形成的噴霧、 DNA 抽提儀器,、試劑及任何與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的東西,。預(yù)防措施：(1)工作區(qū)隔離。(2)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作,，如在加樣過程中避免試劑飛濺,、吸頭離心管使用前高壓處理、試劑分裝成小份一次使用后棄去等。(3)操作程序合理化,，如后加陽性對(duì)照等,。
　　交叉污染的處理方法： 交叉污染指擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)將要擴(kuò)增的樣品或反應(yīng)管的污染。由于 PCR 的敏感性和效率特別高,，所以少量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染標(biāo)本或反應(yīng)管即可出現(xiàn)假陽性,。交叉污染的處理方法包括 [1] ：
1 ．在 DNA 模板和多聚酶加入前，紫外線照射反應(yīng)管內(nèi)容物以破壞污染的 PCR 產(chǎn)物,。一般選用波長(zhǎng) 254nm 照射 30min （ Nature ,， 1990 ， 34:27 ）
2 ． PCR 實(shí)驗(yàn)中使用 dUTP ,，而不用 dTTP ,。在擴(kuò)增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的 PCR 產(chǎn)物，而不降解基困組 DNA 模板,，然后熱滅活此酶,，再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（ Gene ， 1990 ,， 93 ： 125 ）,。美國 PE 公司提供此類試劑盒（ PCR carry-over preventionkit 。
3 ．在 PCR 反應(yīng)前加入一種光化學(xué)試劑,，反應(yīng)完成后激活該試劑,，光化學(xué)試劑可交聯(lián) DNA 鏈，使之不能再擴(kuò)增（ Nucleic Acids Res ,， 1991 ,， 19 ： 99 ）。
二,、假陰性：
　　如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的陽性對(duì)照未能擴(kuò)增成陽性結(jié)果,，提示本次實(shí)驗(yàn)中可能有假陰性結(jié)果。但這里應(yīng)注意,，許多國產(chǎn) PCR 試劑盒中陽性對(duì)照采用質(zhì)粒 DNA ,，和標(biāo)本相比來說，不需純化提取核酸的步驟,，因此,，如果在標(biāo)本核酸純化提取步驟有問題，即使陽性對(duì)照均呈陽性,，標(biāo)本檢測(cè)中還可能有假陰性,。
　　造成假陰性的原因包括: (1) DNA 抽提過程不當(dāng)。 (2) DNA 樣品中含有 Taq 聚合酶抑制劑,，如尿素,、 DMSO ,、 SDS 等物質(zhì)，可抑制 Taq 酶活性,， DNA 樣品中的蛋白質(zhì)和重金屬離子等亦影響 Taq 酶活性,，尤其是含有較多膿液或分泌物的標(biāo)本，其中雖有待查菌,，但卻因標(biāo)本處理不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性 [2] ,。
　　設(shè)置內(nèi)對(duì)照是判斷假陰性較好的指示系統(tǒng),。在每一反應(yīng)管中加入內(nèi)對(duì)照,，若內(nèi)對(duì)照未能擴(kuò)增出來，說明該反應(yīng)管的結(jié)果可能有問題,。
三,、PCR產(chǎn)物的鑒定
　　PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳可判斷其長(zhǎng)度是否為預(yù)期的長(zhǎng)度，但只有通過雜交試驗(yàn)或序列分析等才能判斷其特異性,。嚴(yán)格說來,， PCR 產(chǎn)物均應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)其特異性。在我國一些科研論文和臨床檢測(cè)中缺乏這一環(huán)節(jié),。
　　綜上所述,， PCR 具有其優(yōu)點(diǎn)，但也有不足之處,，它是一種很好的科研手段,，但作為常規(guī)診斷方法尚需進(jìn)一步改進(jìn)和提高 [9] 。目前的關(guān)鍵問題是如何正確應(yīng)用 PCR ,。雖然 PCR 尚未在包括美國等發(fā)達(dá)國家作為常規(guī)診斷方法,，但如果具備開展 PCR 需要的條件， PCR 是可作為輔助診斷手段使用的,。目前,，只有針對(duì) PCR 應(yīng)用中存在的問題，采取措施,，正確應(yīng)用 PCR ,，才能使這一技術(shù)在科研和臨床工作中發(fā)揮應(yīng)有的作用。