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PCR應(yīng)用中存在的問(wèn)題探索
開展 PCR 應(yīng)具有一定的條件。需要一個(gè)正規(guī)的 pCR 實(shí)驗(yàn)室,，采集標(biāo)本,、核酸提取、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析應(yīng)在不同的房間進(jìn)行,；需有嚴(yán)密的防污染措施,、假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的質(zhì)控等。實(shí)驗(yàn)者應(yīng)具有一定的分子生物學(xué)理論知識(shí)及實(shí)驗(yàn)技能,，能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)和糾正實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題,。目前，我國(guó)在 PCR 應(yīng)用中尤其是在臨床診斷中存在問(wèn)題較多,，主要表現(xiàn)為： PCR 試劑的考核,、審查工作薄弱，許多單位實(shí)驗(yàn)條件不符合要求,，部分操作人員的理論和實(shí)驗(yàn)知識(shí)水平較低,。 PCR 的應(yīng)用范圍過(guò)寬等，因此造成 PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性差,，出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性,、假陰性結(jié)果。
一,、假陽(yáng)性：
實(shí)驗(yàn)中設(shè)立的陰性對(duì)照可提示有無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn),。如果一次實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)陰性對(duì)照中出現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中其它標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果可能有假陽(yáng)性,。造成假陽(yáng)性的原因包括樣品污染,、擴(kuò)增試劑污染、擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染等,。常見的污染來(lái)源包括實(shí)驗(yàn)室環(huán)境,、加樣器、操作中形成的噴霧,、 DNA 抽提儀器,、試劑及任何與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸的東西。預(yù)防措施：(1)工作區(qū)隔離,。(2)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作,，如在加樣過(guò)程中避免試劑飛濺、吸頭離心管使用前高壓處理,、試劑分裝成小份一次使用后棄去等,。(3)操作程序合理化,，如后加陽(yáng)性對(duì)照等。
交叉污染的處理方法： 交叉污染指擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)將要擴(kuò)增的樣品或反應(yīng)管的污染,。由于 PCR 的敏感性和效率特別高,，所以少量的擴(kuò)增產(chǎn)物污染標(biāo)本或反應(yīng)管即可出現(xiàn)假陽(yáng)性。交叉污染的處理方法包括 [1] ：
1 ．在 DNA 模板和多聚酶加入前,，紫外線照射反應(yīng)管內(nèi)容物以破壞污染的 PCR 產(chǎn)物,。一般選用波長(zhǎng) 254nm 照射 30min （ Nature ， 1990 ,， 34:27 ）
2 ． PCR 實(shí)驗(yàn)中使用 dUTP ,，而不用 dTTP 。在擴(kuò)增前使用 UraciI N 一 g1ycosylase （尿嘧啶糖基化酶）處理可降解交叉污染的 PCR 產(chǎn)物,，而不降解基困組 DNA 模板,，然后熱滅活此酶，再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（ Gene ,， 1990 ,， 93 ： 125 ）。美國(guó) PE 公司提供此類試劑盒（ PCR carry-over preventionkit ,。
3 ．在 PCR 反應(yīng)前加入一種光化學(xué)試劑,，反應(yīng)完成后激活該試劑，光化學(xué)試劑可交聯(lián) DNA 鏈,，使之不能再擴(kuò)增（ Nucleic Acids Res ,， 1991 ， 19 ： 99 ）,。
二,、假陰性：
如果實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的陽(yáng)性對(duì)照未能擴(kuò)增成陽(yáng)性結(jié)果，提示本次實(shí)驗(yàn)中可能有假陰性結(jié)果,。但這里應(yīng)注意,，許多國(guó)產(chǎn) PCR 試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照采用質(zhì)粒 DNA ，和標(biāo)本相比來(lái)說(shuō),，不需純化提取核酸的步驟,，因此，如果在標(biāo)本核酸純化提取步驟有問(wèn)題,，即使陽(yáng)性對(duì)照均呈陽(yáng)性,，標(biāo)本檢測(cè)中還可能有假陰性。
造成假陰性的原因包括: (1) DNA 抽提過(guò)程不當(dāng),。 (2) DNA 樣品中含有 Taq 聚合酶抑制劑,，如尿素,、 DMSO ,、 SDS 等物質(zhì),，可抑制 Taq 酶活性， DNA 樣品中的蛋白質(zhì)和重金屬離子等亦影響 Taq 酶活性,，尤其是含有較多膿液或分泌物的標(biāo)本,，其中雖有待查菌，但卻因標(biāo)本處理不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性 [2] ,。
設(shè)置內(nèi)對(duì)照是判斷假陰性較好的指示系統(tǒng),。在每一反應(yīng)管中加入內(nèi)對(duì)照，若內(nèi)對(duì)照未能擴(kuò)增出來(lái),，說(shuō)明該反應(yīng)管的結(jié)果可能有問(wèn)題,。
三、PCR產(chǎn)物的鑒定
PCR 產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳可判斷其長(zhǎng)度是否為預(yù)期的長(zhǎng)度,，但只有通過(guò)雜交試驗(yàn)或序列分析等才能判斷其特異性,。嚴(yán)格說(shuō)來(lái)， PCR 產(chǎn)物均應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其特異性,。在我國(guó)一些科研論文和臨床檢測(cè)中缺乏這一環(huán)節(jié),。
綜上所述， PCR 具有其優(yōu)點(diǎn),，但也有不足之處,，它是一種很好的科研手段，但作為常規(guī)診斷方法尚需進(jìn)一步改進(jìn)和提高 [9] ,。目前的關(guān)鍵問(wèn)題是如何正確應(yīng)用 PCR ,。雖然 PCR 尚未在包括美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家作為常規(guī)診斷方法，但如果具備開展 PCR 需要的條件,， PCR 是可作為輔助診斷手段使用的,。目前，只有針對(duì) PCR 應(yīng)用中存在的問(wèn)題,，采取措施,，正確應(yīng)用 PCR ，才能使這一技術(shù)在科研和臨床工作中發(fā)揮應(yīng)有的作用,。