PCR的工作機(jī)制
PCR由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng),，包含前、中,、后三個(gè)階段,。最重要的化學(xué)變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物,、模板,、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會改變,，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài),。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開始。當(dāng)溫度較低時(shí),，引物退火到模板上,。
早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標(biāo)。在中期的循環(huán)中,，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板,。最后幾個(gè)循環(huán)中，增擴(kuò)后的高濃度產(chǎn)物互相雜交,，由此阻止與引物的雜交,。
引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上,，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸,。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應(yīng)都會造成產(chǎn)物擴(kuò)展,，它們的特異性在最初的幾個(gè)循環(huán)中可能很難控制,，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過在模板上正確退火位置的量。PCR反應(yīng)特異性的可靠度依賴于2個(gè)引物必須定位到互補(bǔ)的DNA鏈上,。進(jìn)一步講,，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應(yīng)小于10kb,。
相比之下,，增擴(kuò)階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴(kuò)的片段區(qū)分開,。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個(gè)循環(huán)的嚴(yán)密性,。甄選同源性引物的退火位置是較簡單的，增擴(kuò)期間由染色體DNA貢獻(xiàn)的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分,。甄選的復(fù)雜性被超量由引物從互補(bǔ)位點(diǎn)新增擴(kuò)的片段所降低,。
PCR的化學(xué)計(jì)量
熱力學(xué)方面的影響對PCR來講是試劑濃度和模板間的對應(yīng)關(guān)系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的,，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低,。令人驚訝的是這種減低是由增擴(kuò)的目標(biāo)分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的,，反應(yīng)結(jié)束后,，dNTP的濃度下降超過1倍，引物任然剩余95%,，Taq DNA聚合酶沒有變化,。增擴(kuò)千萬倍目標(biāo)分子后,，模板分子遠(yuǎn)多于酶分子。當(dāng)產(chǎn)物增加后,，酶全部被占用了,，引物和模板的比率減低，推動自身退火,。當(dāng)自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有時(shí),，反應(yīng)處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級的增長。增擴(kuò)階段是自我受限的,。這個(gè)階段之后,，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個(gè)循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標(biāo)增擴(kuò)，盡管能夠通過提高開始時(shí)Taq DNA聚合酶和引物的含量來維持高試劑比率,，但這種修改很可能引起丟失特異性因?yàn)橐飼鷣y雜交,，出現(xiàn)額外的條帶和斑點(diǎn)。
