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新手學(xué)習(xí)PCR注意事項
PCR注意事項
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間
一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測,，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失,。
假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質(zhì)量與特異性,，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究,。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑,，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚,。⑤模 板核酸變性不底,。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處 理,，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改,。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性,。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想,、容易彌散的常見原因,。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高,，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增,，對策為：①選定一個好的引物合成單 位,。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶,，一條引物無條帶,，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度,。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。④引物設(shè)計不合理,，如引物長度不夠,，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul,、50ul?；?00ul,，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,，在做小體積如20ul 后,，再做大體積時，一定要模索條件,，否則容易失敗,。
物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低,，變性時間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一,。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時其條帶更整齊,，亮度更高。
引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性,。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔,，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒,。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時,，在加標(biāo)本前,，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染,，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性,?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后,，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除,。
出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn),，其原因：一是引物與靶序列不全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過高,、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn),，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,，65℃左右退火與延伸)。