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當(dāng)前位置：迪圖（上海）生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>pcr擴(kuò)增的工作原理
PCR實驗是分子生物學(xué)中常見用的實驗之一,，在基因擴(kuò)增,、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應(yīng)用,。pcr擴(kuò)增的原理和步驟如下：
一,、試劑準(zhǔn)備：
PCR常用的試劑主要包括 DNA 模板、引物,、ddH 2 O,、 DNA 聚合酶以及特定的反應(yīng)緩沖液、dNTP,、MgSO 4（可選）和 DMSO （可選）,。
二、PCR實驗前的準(zhǔn)備
在開始PCR實驗之前,，必須準(zhǔn)備好DNA模板（基因組DNA 或逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA）,、特異性引物（自己設(shè)計或用軟件設(shè)計），并選擇合適的商業(yè)酶（選擇符合您實驗?zāi)康牡拿?
1.DNA聚合酶,。有許多商業(yè) DNA 聚合酶,，它們具有不同的特性。一般分為兩類：高保真聚合酶和普通Taq 聚合酶,。如果您想對沒有任何突變的特定 DNA 片段進(jìn)行 PCR,，請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在,，就選擇普通的 Taq 聚合酶,。如果要對T-vector連接的片段進(jìn)行PCR，要注意 ,，因為大多數(shù)高保真聚合酶的產(chǎn)物都沒有 A-tailing,，所以應(yīng)該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR 實驗后添加 A-tailing。
2.引物的特異性影響 PCR 成功的概率,，良好的引物設(shè)計對 PCR 擴(kuò)增的成功至關(guān)重要,。當(dāng)您開始設(shè)計引物時，應(yīng)仔細(xì)考慮以下幾個原則：
①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右,。這對于引物特異性和在退火溫度下的結(jié)合來說是足夠長的,。
②熔化溫度(Tm)。Tm 定義為在此溫度下,，DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA,。52-58C 范圍內(nèi)的引物 Tm 是最佳的。
③GC 含量,。最佳 GC 含量應(yīng)為 40-60%,。
④許多軟件可用于引物設(shè)計，例如primer5和Oligo,。這些軟件推薦的引物通?？梢詽M足我們的需求。
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