PCR(Polymerase Chain Reaction),,是指在DNA聚合酶催化下,,以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點(diǎn),。通過變性,、退火、延伸等步驟,體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程,。 經(jīng)典的PCR擴(kuò)增反應(yīng)分為三步:
1,、高溫變性:模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈解離,,使之成為單鏈,,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備,;
2,、低溫退火:模板DNA與引物的復(fù)性,模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,,溫度降至55℃左右,,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合;
3,、適溫延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在72℃,、DNA聚合酶的作用下,以核苷酸為反應(yīng)原料,,靶序列為模板,,按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈,。
![1852196-.jpg 1852196-.jpg](https://img68.chem17.com/9/20230728/638261535074303134424.jpg)
影響擴(kuò)增的因素:
1,、由于各種原因,造成的PCR擴(kuò)增體系中出現(xiàn)了非目的檢測樣本本身的模板,,使得PCR結(jié)果出現(xiàn)假陽性
2,、操作錯誤或者誤差造成的模板間交叉污染
3、PCR試劑的污染
4,、PCR實(shí)驗(yàn)器材的污染
5,、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的氣溶膠污染
防止污染的首要原則是要設(shè)置NTC(No Template Contro|)對照,,一個不含有模板DNA但含有PCR體系中所有其他成分的對照。如果不能在污染的第一時間發(fā)現(xiàn),,會導(dǎo)致后續(xù)一系列的數(shù)據(jù)無法使用,。準(zhǔn)備PCR體系的移液器要,千萬不能用吸取過PCR產(chǎn)物的移液器去準(zhǔn)備PCR體系,。