確認RNA的質量常用的三種方法
實時熒光定量PCR技術是通過測定RNA的轉錄水平來評估基因的活力,。RNA樣本提取的質量直接影響基因表達分析,。影響RNA品質的因素有以下三種:RNA濃度,、RNA純度和RNA完整性,。
檢測RNA濃度,、純度和完整性的方式主要有以下幾種:
紫外分光光度計法:
測量260nm吸收值計算RNA濃度,測量260nm/280nm吸收值的比值,,用于評估RNA純度,。需要注意的是:在檢測核酸物質時應該在固定的PH溶液中進行。
260nm/280nm的比值范圍在 1.9~2.1 之間,。<1.9,,說明有蛋白質殘留;>2.1,說明RNA可能發(fā)生降解,。
瓊脂糖凝膠電泳:
完整的RNA通常有三條帶,,最亮的是28S條帶,其次是18S條帶,,最淡的是5S條帶(部分試劑盒提取時會過濾掉5S條帶),。通過瓊脂糖凝膠電泳可以檢測28S和18S的比值。該方法主要用于檢測RNA的純度和完整性,。
如果28S和18S條帶明亮,、清晰、條帶銳利,,28S的亮度在18S條帶的兩倍以上,,我們認為RNA的質量。
若RNA條帶出現彌散,,原因可能:RNA被核酸酶降解,、電壓或電流過大、上樣量過高或過低等,。
上述兩種方法在實驗室比較常用,,此外還有幾種檢測方式供大家選擇。
熒光染料檢測:
通過熒光染料和RNA結合,,熒光活性增強,。此方法的靈敏度較高,主要用于檢測RNA的濃度,。
微毛細管電泳:
可使用軟件的RIN(RNA Integrity Number)分數評估,,10為RNA完整性最好,0為最差,。此方法的靈敏度和分辨率較高,,可用于檢測RNA濃度、純度和完整性,。
3’-5’完整性檢測:
是在一個RNA樣本中檢測GAPDH mRNA的完整性來代表所有RNA的完整性,,主要用于檢測RNA的完整性。