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一,、實驗材料: 疾病對應的細胞系(或者是原代細胞),預算充足情況下可以選擇2種細胞系,,暫定為:A和B細胞
二,、實驗方案:敲低兩種細胞的目的基因1、過表達兩種細胞的目的基因1(若是miRNA可以使用mimics,、inhibitor)
三,、干擾片段篩選:2種細胞都需要篩選(當用mimics和inhibitor時也需要初步篩選表達效果)
目的基因1干擾片段篩選:針對目的基因1設計并合成3條siRNA及NC,轉染細胞,,QPCR篩選出干擾 的片段進行后續(xù)實驗;
四,、實驗分組:A或B細胞
A
A+siRNA NC對照組
A+siRNA目的基因1干擾
A+過表達目標基因1
A+過表達空載
抑制劑處理濃度1
五,、檢測項目:
細胞增殖或者細胞毒性檢測(CCK法/MMT),,
流式檢測細胞周期,
流式檢測細胞凋亡,,
細胞侵襲實驗(transwell),,遷移、劃痕
WB檢測細胞信號通路中蛋白的表達變化,,
QPCR檢測信號通路中基因的表達,,
免疫熒光檢測下游信號通路蛋白
流式多色檢測某些marker指標
Coip檢測A和B蛋白是否結合
雙熒光素酶檢測A和B是否結合
油紅O染色
生化檢測:SOD,CAT等
透射電鏡
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