聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

一,、發(fā)展簡(jiǎn)史

     聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn),，是能將微量的DNA大幅增加,。因此，無(wú)論是化石中的古生物,、歷史人物的殘骸,，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液,，只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA，就能用PCR加以放大,，進(jìn)行比對(duì),。這也是"微量證據(jù)"的威力之所在。

    1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想,，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生,。

二,、實(shí)驗(yàn)原理

    類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。

首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈,，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度,，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸,。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過(guò)程就是一個(gè)PCR循環(huán),。

PCR過(guò)程是由變性，退火,，延伸3個(gè)步驟組成的不斷重復(fù)的過(guò)程,。標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂,，形成單鏈DN

2.退火（復(fù)性）（40℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈,。

3.3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下,，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸,，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈,。

每一循環(huán)經(jīng)過(guò)變性、退火和延伸,，DNA含量既增加一倍,。

三、PCR反應(yīng)要素：

1. DNA模版：可以是雙鏈、單鏈,、提取染色體的DNA,、克隆的質(zhì)粒DNA，

2. 引物：一對(duì)寡聚DNA,，分別與模板兩側(cè)的3’端序列互補(bǔ),，可使DNA序列得到擴(kuò)增

3. DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）：催化DNA合成，

4. 緩沖液：提供DNA合成反應(yīng)所需的PH,離子強(qiáng)度等環(huán)境

5. 4種單核苷酸：dNTP,提供DNA合成原料

• 實(shí)驗(yàn)材料

     PCR擴(kuò)增儀,、PCR反應(yīng)管,、PCR離心管、移液器,、凝膠電泳設(shè)備,、冰盒、離心機(jī)

模板,、PCR引物,、TaqDNA聚合酶、dNTP反應(yīng)緩沖液,、Mg2+,、ddH2O。

• PCR反應(yīng)體系

1. 以DNA為模板的反應(yīng)體系：

  模板：DNA102~105拷貝

  引物

  底物：4種dNTP

  TaqDNA聚合酶

  緩沖液

  體積：

1. 以mRNA為模板的反應(yīng)（逆轉(zhuǎn)錄PCR）

  模板：RNA

  引物：oligo(dT)12~18

  底物：4種dNTP

  逆轉(zhuǎn)錄酶

  緩沖液

  其他試劑：RNA酶抑制劑,，MgCl2.DTT.