調(diào)試和校準(zhǔn)
流式細(xì)胞儀在使用前,，甚至在使用過程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性和性,。調(diào)試的項目主要是激光強度,、液流速度和測量區(qū)的光路等。
(1) 激光強度調(diào)節(jié)：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外,，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為大,。
(2) 液流速度調(diào)節(jié)：可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié) 氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度,。
(3) 測量區(qū)光路調(diào)節(jié)：這是調(diào)試工作的關(guān)鍵,。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束,、90散射測量光電系統(tǒng)垂直正交,，而且交點較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成,。
流式細(xì)胞術(shù)中所測得的量是相對值,，因此需要在使用前或使用中對系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定，這樣才能通過相對測量獲得對的意義,。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度,。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形,，樣品分散性能良好,，且經(jīng)濟、容易獲得,。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品,，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。
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微球用樹脂材料制作,，或標(biāo)有熒光素,，或不標(biāo)記熒光素。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血(抗凝劑：雞血=1：4),，經(jīng)PBS清洗3次,，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合，室溫下振蕩醛化24h,，后經(jīng)PBS再清洗,，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因為未經(jīng)熒光染色,，所測光信號為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。
1.4.2 儀器的操作和使用
(1) 打開電源,，對系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱,；
(2) 打開氣體閾，調(diào)節(jié) 壓力，獲得適宜的液流速度,；開啟光源冷卻系統(tǒng),；
(3) 在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng),；
(4) 利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品,，調(diào)整儀器，使在激光功率,、光電倍增管電壓,、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0和90散射的熒光強度強,，并要求變異系數(shù)為?。?/div>
(5) 選定流速,、測量細(xì)胞數(shù),、測量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品;同時選擇計算機屏上數(shù)據(jù)的顯示方式,，從而能直觀掌握測量進(jìn)程,；
(6) 樣品測量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng),；
(7) 因為實驗數(shù)據(jù)已存入計算機硬盤(有的機器還備有光盤系統(tǒng),，存貯量更大)，因此可關(guān)閉氣體,、測量裝置,，而單獨使用計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；
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(8) 將所需結(jié)果打印出來,。
1.4.3 操作和使用中的注意事項
(1) 光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件,，暴露的較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作,；另外還要注意磁屏蔽,；
(2) 光源不得在短時間內(nèi)(一般要1h左右)關(guān)上又打開;使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；
(3) 液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通,，避免氣泡栓塞,，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒,；注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng),、放大器的類型等；
(4) 特別強度每次測量都需要對照組
