從1985年至今的30多年時(shí)間里,，PCR分析經(jīng)歷了三代技術(shù)的發(fā)展,。一代傳統(tǒng)PCR技術(shù)，采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性分析,。第二代熒光定量PCR技術(shù),，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR進(jìn)程,，后用Cq值對基因進(jìn)行定量分析,。第三代數(shù)字PCR技術(shù)，通過將PCR反應(yīng)液進(jìn)行有限稀釋,，實(shí)現(xiàn)核酸分子的單分子擴(kuò)增,，終采取終點(diǎn)法檢測陽性微滴的熒光信號，有熒光信號的微滴判讀為 1,；沒有熒光信號的微滴判讀為 0,，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。

PCR技術(shù)在不斷地蛻變卻從未淡出我們的視野,，如今已經(jīng)滲透到分子生物學(xué)領(lǐng)域的各種研究層面,。尤其在今年大流行疾病中，展現(xiàn)了PCR技術(shù)的強(qiáng)大之處,。那在科學(xué)研究中,，我們該如何選擇傳統(tǒng)PCR 、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR呢,？

首先我們要清楚,，三代PCR技術(shù)所有的基礎(chǔ)源于PCR反應(yīng)的基本原理和PCR反應(yīng)的3個(gè)重要階段，分別是指數(shù)期,、線性期和平臺期,。

指數(shù)期

指數(shù)期內(nèi)，每個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物量大約增加1倍（假定 100%反應(yīng)效率）,，該階段的擴(kuò)增反應(yīng)具有高度特異性和精度,。

線性期（高變異性）

隨著PCR反應(yīng)體系成分的消耗，其中的一個(gè)或者多種成分限制反應(yīng),，導(dǎo)致反應(yīng)開始減緩,，并且每個(gè)循環(huán)的PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺期

反應(yīng)停止,，不再產(chǎn)生更多的產(chǎn)物,。因?yàn)槊總€(gè)樣品具有不同的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，所以每個(gè)反應(yīng)將在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入平臺期,，平臺期內(nèi)可以看到這些差異,。

傳統(tǒng) PCR

傳統(tǒng)PCR通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR終產(chǎn)物進(jìn)行分析（圖2）,，它的局限性就在于只能做定性分析。在圖3中,，3個(gè)反應(yīng)孔含有相同量的 DNA模板,，但到達(dá)平臺期后產(chǎn)生的熒光信號卻不同，說明擴(kuò)增產(chǎn)物的量存在不同（反應(yīng)動(dòng)力學(xué)變化所致）,。這也表明了傳統(tǒng)PCR平臺期測量時(shí)結(jié)果存在變異,，產(chǎn)出的DNA量不一定能反映初情況，所以無法進(jìn)行定量,。

熒光定量 PCR

同樣在圖3中,，發(fā)現(xiàn)在指數(shù)期內(nèi)，3個(gè)反應(yīng)孔的擴(kuò)增曲線*重合,，說明指數(shù)期內(nèi)進(jìn)行檢測將更加確,，可實(shí)現(xiàn)更加準(zhǔn)確的定量。閾值線是擴(kuò)增產(chǎn)物熒光強(qiáng)度超過背景時(shí)的一個(gè)熒光強(qiáng)度值,，樣品達(dá)到此熒光強(qiáng)度值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)稱為Cq值,。通過比較未知濃度的樣品與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的Cq值，可以測定未知反應(yīng)中的模板 DNA數(shù)量,。

數(shù)字 PCR

數(shù)字 PCR 是通過將樣本DNA隨機(jī)分布至獨(dú)立的反應(yīng)單元中,，每個(gè)反應(yīng)單元中包含或者不包含1個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子，所有獨(dú)立的反應(yīng)單元進(jìn)行平行擴(kuò)增后,，對每個(gè)反應(yīng)單元的陰性或者陽性熒光信號進(jìn)行檢測并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,，就可以計(jì)算出原始樣本的拷貝數(shù)，無需參考標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)源性對照品,，也不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

傳統(tǒng)PCR ,、熒光定量 PCR與數(shù)字 PCR的選擇