在做qPCR實驗時，我們經(jīng)常會問：“你是做定量還是相對定量呢,？”,，而定量方法的選擇是取決于實驗的目標(biāo)。定量可測定目標(biāo)核酸分子的實際拷貝數(shù),，但也是費力,、復(fù)雜的定量形式。此方法要求周密的實驗方案和高度準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線，常用于確定病毒滴度,。

使用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量

定量是通過樣品的Cq值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較實現(xiàn)的,。首先為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，需要已知拷貝數(shù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,，對標(biāo)準(zhǔn)品進行5次以上的連續(xù)梯度稀釋,，將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進行實時熒光定量PCR擴增，后根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應(yīng)的Cq值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，得到線性方程Cq= -klgX0+b,，其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較,，確定其拷貝數(shù)濃度,。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)模板起始濃度越大時,，熒光達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)越少,，即Cq值越小。反之,，模板起始濃度越小時,，Cq值越大。起始模板量的Log值與循環(huán)數(shù)Cq值呈線性關(guān)系,，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，即可確定未知待測樣本中目的基因的量。

如何選擇標(biāo)準(zhǔn)品,？

如前所述,，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的模板將決定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度。所以使用與實驗樣本盡可能類似的目標(biāo)模板,，可優(yōu)選有證的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考物質(zhì),。那么制備標(biāo)準(zhǔn)品的常見方法如下：

?  DNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點的PCR擴增片段或含有目的靶點的質(zhì)粒克?。▓D2）,。

優(yōu)點：易于生成、定量,，可在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下維持穩(wěn)定性,。

缺點：無法進行qRT-PCR 的逆轉(zhuǎn)錄步驟，大大影響了反應(yīng)效率,。

PCR擴增片段：通過常規(guī)PCR進行目的片段擴增,，回收純化PCR擴增片段，可直接作為標(biāo)準(zhǔn)品,，相對于質(zhì)粒,，PCR擴增片段不是那么穩(wěn)定,。

質(zhì)粒克?。簩⒛康钠芜M行PCR擴增,，回收目的條帶后連入T載體，再進行質(zhì)粒提取,，OD值定量,，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品使用。

?  RNA 標(biāo)準(zhǔn)品：目的靶點的體外轉(zhuǎn)錄RNA(圖3)

優(yōu)點：結(jié)合了RT效率,，程度地模擬了目的靶點。

缺點：需要耗費時間生成該標(biāo)準(zhǔn)品,，因其不穩(wěn)定,，難以保持長期準(zhǔn)確度。

體外轉(zhuǎn)錄RNA：利用實時熒光定量PCR生成的PCR 產(chǎn)物可利用包含5’ T7啟動子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆轉(zhuǎn)錄引物重新擴增,。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成多聚腺苷酸化正義mRNA,。純化后可將其準(zhǔn)確定量并稀釋，用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

Azure  Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)——定量示例

•方法:從組織中提取基因組DNA,，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

•試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)