一.ELISA 標(biāo)準(zhǔn)操作要點
的試劑,，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件,。ELISA 中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的,，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電導(dǎo)率小于1.5μs/cm。
1. 標(biāo)本的采取和保存
大部分ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本,。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集,，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP 為標(biāo)記的ELISA 測定中,，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測,。如有細(xì)菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng),。一般說來,，在5 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃，標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG 聚合,，使間接法的試劑本底加深,。*過一周測定的需－20℃保存。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡,?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測,。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落,，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作,，也可加入適當(dāng)防腐劑,。
抗凝不*的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝劑,。
2.加樣
加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,。
3.保溫
在建立ELISA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)
1-2 小時,，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為避免蒸發(fā),，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放,，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成,，采用水浴會造成值偏高或花板,。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會偏高,，建議為了客觀的判斷結(jié)果,，將質(zhì)控放在非邊緣位置。
4.洗滌
洗滌在ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,，但卻決定著實驗的成敗,。ELSIA 就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是主要的關(guān)鍵技術(shù),，應(yīng)引起操作者的高度重視,，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎,。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),，也含親水基團(tuán),，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用,，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度,。
洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用,。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋,，所用的水電導(dǎo)率好在1.5us/cm 之下,，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為40 秒左右,，孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好,，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。