PCR就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制,。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍,。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn),，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀,，原位PCR儀,，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類,。

基本要素

基本的PCR須具備

1.要被復(fù)制的DNA模板 Template

2.界定復(fù)制范圍兩端的引物Primers.

3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

4.合成的原料（四種脫氧核苷酸）及水。

工作原理

利用升溫使DNA變性,，在聚合酶的作用下使單鏈復(fù)制成雙鏈,，進(jìn)而達(dá)到基因復(fù)制的目的。

反應(yīng)步驟

分別是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers,。 所謂 Denaturing乃是將DNA加熱（至90~95℃）變性,， 將雙股的DNA加熱后轉(zhuǎn)為單股DNA以做為復(fù)制的模板. 而Annealing 則是令 Primers于一定的溫度下（冷卻至55~60℃）附著于模板DNA兩端。 后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下（加熱至70~75℃）進(jìn)行引物的延長(zhǎng) Extension of primers及另一股的合成,。

PCR的早設(shè)想核酸研究已有100多年的歷史,，二十世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù),，Korana于1971年早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性,，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物,，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”,。

實(shí)現(xiàn)

1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制,，只是改進(jìn)與完善Mullis初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段,，其缺點(diǎn)是：

①Klenow酶不耐高溫， 90℃會(huì)變性失活,，每次循環(huán)都要重新加,。

②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配,，其PCR產(chǎn)物特異性較差,，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn),，但由于Klenow酶不耐熱,，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化,，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期,，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視,。

1988年初,，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一,，真實(shí)性也較高,，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次,，仍需加入新酶,。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermus aquaticus 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。 此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫,，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來(lái)的90%,，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的40%,。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化,，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率,，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度2.0Kb,。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高,。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別,，將此酶命名為TaqDNA多聚酶Taq DNAPolymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用,。

分類

普通的PCR儀

把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀,，叫傳統(tǒng)的PCR儀，也叫普通PCR儀,。如果要做不同的退火溫度需要多次運(yùn)行,。主要是做簡(jiǎn)單的，對(duì)目的基因退火溫度的擴(kuò)增,。該儀器主要應(yīng)用于科研研究,，教學(xué)，醫(yī)學(xué)臨床,，檢驗(yàn)檢疫等機(jī)構(gòu),。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常有12種溫度梯度,，這樣的儀器就叫梯度PCR儀,。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同DNA片段，其適退火溫度是不同的,，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增,，從而一次性PCR擴(kuò)增，就可以篩選出表達(dá)量高的適退火溫度,，進(jìn)行有效的擴(kuò)增,。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間,。主要用于科研,，教學(xué)機(jī)構(gòu)。梯度PCR儀,，在不設(shè)置梯度的情況下也可以做普通PCR擴(kuò)增,。具有雙槽梯度的不多,，領(lǐng)成具備此功能。

原位PCR儀

用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀,，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等,。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中,，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增,，不但可以檢測(cè)到靶DNA，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置,，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實(shí)用價(jià)值,。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

在普通PCR儀的基礎(chǔ)上增加一個(gè)熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，就成了熒光定量PCR儀,。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR儀擴(kuò)增原理相同,，只是PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記,，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增,。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。把這PCR儀叫做實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(qPCR儀）