操作步驟

熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)步驟:

折疊樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細(xì)胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的,，蓋緊管蓋,。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘,。4℃下12000rpm離心15分鐘,。離心后混合液體將分為下層的紅色酚相，中間層以及無色水相上層,。RNA全部被分配于水相中,。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中,。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘,。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊,。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),，清洗RNA沉淀,。混勻后,，4℃下7000rpm離心5分鐘,。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘,。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí),，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解,，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用,。

折疊RNA質(zhì)量檢測

1)紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值,，測定RNA溶液 濃度和純度,。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為:A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml,。具體計(jì)算如下:

RNA溶于40 μl DEPC水中,，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中,，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

取5ul用來測量以后,，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為:

35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,，比值范圍1.8到2.1,。

2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃,，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M),。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板,，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液,。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi),，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米,。

②準(zhǔn)備RNA樣品

取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液,，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml,。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min,，隨后將樣品加入上樣孔,。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm,。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶,，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),，可能是由mRNA和其它異型RNA組成,。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

折疊樣品cDNA合成

①反應(yīng)體系

輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心,。

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘,，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液,，保存于-80℃待用。

折疊樣品

管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR

①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為10,，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為10,，依次稀釋至10、10,、10,、10、10,、10,，以備用。

②反應(yīng)體系如下:

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心,。

管家基因反應(yīng)體系:

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心,。

③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時(shí)上機(jī),，反應(yīng)條件為:93℃2分鐘，然后93℃ 1分鐘,，55℃ 2分鐘,，共40個(gè)循環(huán)。

折疊模板

①針對每一需要測量的基因,，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng),。

反應(yīng)體系:

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心,。

35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘,。

②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色,，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶,。

③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×10，依次稀釋至10,、10,、10,、10、10,、10幾個(gè)濃度梯度,。

折疊PCR

①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。

體系配置如下:

輕彈管底將溶液混合,，6000rpm短暫離心,。

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93℃2分鐘預(yù)變性,，然后按93℃ 1分鐘,，55℃1分鐘，72℃1分鐘,，共40做個(gè)循環(huán),，后72℃7分鐘延伸。

折疊引物列表

引物設(shè)計(jì)軟件:Primer Premier 5.0,，并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補(bǔ);引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配),。

折疊電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,，GoldView染色,，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。