凡是需要做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的lab,，肯定逃不了要買一臺(tái)核酸定量的機(jī)器,。目前流行的儀器是Nanodrop One,，只需滴加一兩微升的樣品，按一下按鈕,，利用核酸的紫外吸收特性,，即可得到濃度數(shù)據(jù)。近幾年,，以Qubit 4為代表的基于特異熒光染料法的儀器也逐漸進(jìn)入科研人員的視野,。那么，這兩類儀器有什么區(qū)別,，在使用時(shí)需要注意什么,，如何根據(jù)實(shí)驗(yàn)室需求來選購？且聽老司機(jī)分解,。

首先我們需要來理解兩臺(tái)儀器在核酸定量原理上的區(qū)別,。正如方才所言,，Nanodrop One利用了核酸的紫外吸收特性。

（圖1：Nanodrop One）

核酸,，包括DNA和RNA,，均由核糖、磷酸基以及堿基構(gòu)成,。其中,，由于堿基含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，因此具有紫外吸收的特性,。核酸的特征吸收波長為260 nm,。根據(jù)朗伯比爾定律，已知物質(zhì)的消光系數(shù)（幾十年前早已測量）,，液層的厚度（固定的樣品室）,，就能利用其吸光度來計(jì)算出物質(zhì)的濃度。與此同時(shí),，還能通過計(jì)算A260/A280和A260/A230的數(shù)值,，估計(jì)核酸的純度。（280 nm吸光通常來自蛋白質(zhì),，而230 nm則通常來自糖類和苯酚等。）

而Qubit 4這一類儀器采用的是熒光染料法,。這些熒光染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結(jié)合,，并在特定波長光源的激發(fā)下，發(fā)出熒光,。其中,，結(jié)合了核酸的熒光染料，相比那些游離的,，信號可增幅數(shù)十倍至數(shù)百倍,，因此可以和背景區(qū)分開來。目前,，做測序的實(shí)驗(yàn)室基本把Qubit 4當(dāng)標(biāo)配儀器了,。

（圖2：Qubit 4.0）

雖然以Nanodrop One為代表的紫外吸收法在科研領(lǐng)域已經(jīng)沿用了數(shù)十年，但由于原理上的限制,，這一類儀器有無法避免的缺陷,。

1、紫外吸收法無法區(qū)分DNA和RNA

這一點(diǎn)其實(shí)在原理上就很好理解了,。如下圖所示,，具有紫外吸收的結(jié)構(gòu)是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基,，因此當(dāng)一份樣品同時(shí)含有DNA和RNA的時(shí)候,，無論你本意是想測哪一個(gè),，均會(huì)高估其真實(shí)濃度。

（圖3：核酸的結(jié)構(gòu)）

而Qubit 4的熒光染料法則避免了這個(gè)問題,。只要采用DNA,、RNA特異的染料，就能有選擇性地測定樣品中的核酸濃度,。下圖是Qubit 4的*測試數(shù)據(jù),。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是在DNA樣品中混合入不同比例的RNA，并用Qubit 法和紫外吸收法分別進(jìn)行測定,。當(dāng)DNA的樣品足夠純時(shí)（DNA：RNA = 10：0）,，兩種方法測得的數(shù)值并沒有顯著區(qū)別。但當(dāng)混入的RNA越來越多,，紫外吸收的數(shù)值也跟著升高（藍(lán)色和綠色柱子）,，而使用雙鏈DNA染料的Qubit數(shù)值則沒有改變（紅色柱子）。使用RNA染料用Qubit 4進(jìn)行測定,，則會(huì)發(fā)現(xiàn),，隨著RNA混入的增加，讀數(shù)也跟著升高,。

（圖4：Qubit和紫外吸收法對DNA-RNA混合樣品的測定）

目前,，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質(zhì)均有特異的熒光染料,。也就是說,，無需專門純化樣品，或者在未知污染程度的情況下,，使用Qubit可以方便地得知濃度信息,。

2、紫外吸收法的定量限較高

記得有一次做實(shí)驗(yàn),，放了0.5 µg質(zhì)粒做酶切,，跑膠回收于30 µl的溶液中，然后做Nanodrop測定濃度,，后數(shù)值約為25 ng/µl……

于是本司機(jī)得到的結(jié)論是：我們實(shí)驗(yàn)室的那臺(tái)Nanodrop一定是內(nèi)置了賢者之石（霧——） 還是去隔壁借用一下Qubit吧,。

其實(shí)是這樣的，對于任何儀器分析,，我們都應(yīng)該去理解其檢出限和定量限,。Nanodrop標(biāo)稱的檢出限是2 ng/µl（雙鏈DNA），然而定量限則遠(yuǎn)高于此,。其他的Nanodrop one用戶也有類似的體驗(yàn),，曾經(jīng)在ResearchGate上看到說，低于50 ng/µl的話就容易測不準(zhǔn),，變異度會(huì)增大,。以下同樣是來自Qubit的*數(shù)據(jù),。當(dāng)DNA的濃度低于某個(gè)程度時(shí)，紫外吸收法的偏差和變異度就突破天際了,。

（圖5：Qubit與紫外吸收法測定低濃度DNA時(shí)的偏差及變異度比較）

這兩張圖中,，紫外吸收法得到的偏差和變異度在我看來已經(jīng)算小的了（不能搞太大啊，不然沒人買怎么辦,？數(shù)據(jù)來自Thermo Fisher公司,，但他們家兩類儀器都有,，手心手背都是肉）,，要低于4 ng/µl雙鏈DNA才會(huì)亂飆車,。然而在實(shí)際使用中，低于10甚至20 ng/µl時(shí)就比較容易出亂子,。而PCR產(chǎn)物膠回收等應(yīng)用,，終的實(shí)際濃度往往就落在這個(gè)容易測不準(zhǔn)的范圍內(nèi)。雖然這對老司機(jī)們來說還不至于把下游實(shí)驗(yàn)搞砸,，但測不準(zhǔn)還是很郁悶的,。

3、紫外吸收法對溶液的pH和鹽濃度敏感

在研究物質(zhì)吸光度時(shí),，我們總要明確地定義緩沖液的離子強(qiáng)度以及pH,，這就說明，吸光度本身是受到這兩個(gè)因素影響的,。

通常而言,，偏酸的溶液，容易給出偏低的A260/A280數(shù)值,。相反，偏堿的溶液則容易高估,。相應(yīng)地,，也有報(bào)道稱，當(dāng)用水作為溶劑時(shí),，紫外吸收測定的數(shù)值變異度增大,，而當(dāng)使用Tris或Tris-EDTA溶液進(jìn)行測定時(shí)，重復(fù)性就提高了,。這其中的原因,，很可能是空氣中溶解入水中的CO2濃度差異造成的。離子強(qiáng)度對于紫外吸收的影響比較復(fù)雜,，這里不展開,。

相比之下，熒光染料法對樣品的污染和pH等的容忍度較大,。

4,、紫外吸收法對降解比較嚴(yán)重的核酸無能為力

這一點(diǎn),，同樣也是由紫外吸收原理的局限性所決定的。紫外吸收測定的對象是堿基,，因此無論核酸是完整成鏈的,，還是降解成單個(gè)游離核苷酸，該方法均無法加以區(qū)分,。盡管我們可以通過A260/A280數(shù)值是否過大來估計(jì)核酸樣品的降解狀況,，但卻無法選擇性地只測定那些結(jié)構(gòu)完整的核酸的濃度。

而熒光染料通常結(jié)合的是核酸的鏈結(jié)構(gòu),，并不會(huì)與游離的單核苷酸相互作用,。不過話說回來，對于那些尚未降解成單個(gè)核苷酸而呈短鏈狀態(tài)的核酸,，熒光染料法是無法將其與完整核酸區(qū)分開來的,。

[咚咚咚！敲黑板,！]

但是,，紫外吸收法也不是一味的爛，熒光染料法也不是說吊打（大面積吊打還是做得到）,。

如果在實(shí)驗(yàn)中獲得的核酸樣品總是很純凈且均一（如原材料是容易對付的培養(yǎng)細(xì)胞,，還用品質(zhì)好的試劑盒進(jìn)行抽提；而非奇奇怪怪的樣品,，還要是自己配的試劑）,，同時(shí)產(chǎn)量又很高，那紫外吸收法*可以勝任,，外加測定速度熒光染料法,。此外，熒光染料法對溫度比較敏感,，比如上一回是在25℃室溫制作并儲(chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)曲線,，而這一回要測定樣品時(shí)實(shí)驗(yàn)室空調(diào)壞掉，一下子有了3℃以上的溫差,，那么標(biāo)曲就得重新制作,。同時(shí)，熒光染料要現(xiàn)用現(xiàn)配,，樣品至少要染2 min,，花費(fèi)的時(shí)間比紫外吸收法要長。

以下用一張表總結(jié)兩者的優(yōu)劣,。請根據(jù)自己的實(shí)際情況斟酌,。