詳述PCR擴(kuò)增帶異常的原因及解決方法

使用PCR時(shí),，較為常碰到的問(wèn)題就是會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增帶有異。借此機(jī)會(huì),，我們與大家探討一下PCR擴(kuò)增條帶有異時(shí)的原因及解決方案,。   

假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,；②引物的質(zhì)量與特異性,；③酶的質(zhì)量；④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究,。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)；②模板中含有Taq酶抑制劑,；③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈,，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多,，或吸入酚,；⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶,，或新舊兩種酶同時(shí)使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠,。

引物：引物質(zhì)量,、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱(chēng),，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想,、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題,，兩條引物一條濃度高,，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱(chēng)擴(kuò)增,，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位,。②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,，如一條引物有條帶,，一條引物無(wú)條帶,，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度,。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效,。④引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長(zhǎng)度不夠，引物之間形成二聚體等,。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過(guò)高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul,、30ul、50ul 或100ul,，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后,，再做大體積時(shí),，一定要模索條件，否則容易失敗,。

物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)相當(dāng)重要,，如變性溫度低，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性,；退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率,，退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性,、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一,。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

假陽(yáng)性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,，有時(shí)其條帶更整齊,，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性,。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,，導(dǎo)致假陽(yáng)性,。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用,。必要時(shí),，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸,。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性,。可互相拼接,，與引物互補(bǔ)后,，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除,。

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶,。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體,。二是Mg2+離子濃度過(guò)高,、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān),。其次是酶的質(zhì)和量,，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物,。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）。