您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
詳述Pcr儀的四大分類及常見問題解答
詳述Pcr儀的四大分類及常見問題解答
PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成,，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復(fù)制,。目前常用的技術(shù),，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍,。根據(jù)DNA擴增的目的和檢測的標準，可以將PCR儀分為普通PCR儀,，梯度PCR儀,，原位PCR儀，實時熒光定量PCR儀四類,。
普通PCR儀
一般把一次PCR擴增只能運行一個特定退火溫度的PCR儀,，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行,。主要是用作簡單的,，對目的基因退火溫度的擴增。
主要應(yīng)用于科研,、教學(xué),、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗,、檢疫等,。
梯度PCR儀
一次性PCR擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。因為被擴增的不同的DNA片段其較為適合的退火溫度不同,，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進行擴增,，從而一次性PCR擴增就可以篩選出表達量高的較為適合退火溫度進行有效的擴增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴增，這樣既節(jié)約時間,，也節(jié)約經(jīng)費,。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當做普通的PCR用。正真的梯度,，是每一排管都有的加熱控溫探頭,，2009年為止只有美國ABI公司可以做到。其他的都是從兩頭的熱傳遞來設(shè)計控溫,。
梯度PCR儀多應(yīng)用于科研,、教學(xué)機構(gòu)。
原位PCR儀
（有些品牌的PCR儀具有普通PCR,、梯度PCR,、原位PCR的功能，通過替換模塊進行多用途開展實驗工作）
是用于從細胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細胞內(nèi)基因擴增儀,。如病原基因在細胞的位置或目的基因在細胞內(nèi)的作用位置等,。可保持細胞或組織的完整性,，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細胞中，在細胞的靶DNA所在的位置進行基因擴增,。不但可以檢測到靶DNA,，還能標出靶序列在細胞內(nèi)的位置。于分子和細胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實用價值,。
實時熒光定量PCR儀
在普通PCR儀設(shè)計基礎(chǔ)上增加熒光信號激發(fā)和采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng),，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴增原理和普通PCR擴增原理相同,，在PCR擴增時加入的引物是利用同位素,、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增,。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng),，得出量化的實時結(jié)果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道,，雙通道和多通道之分,。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道,；有多種熒光標記的時候使用多通道,。單通道也可以檢測多熒光的標記和目的基因表達產(chǎn)物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量,，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量,。多通道利于做多重PCR，實現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。
實時熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測,、生物醫(yī)藥研發(fā),、食品行業(yè)、科研院校等,。
PCR儀常見問題及回答
1. cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
*RNA模板質(zhì)量低
*對mRNA濃度估計過高
*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
*同位素磷32過期
*反應(yīng)體積過大,，不應(yīng)*過50μl
2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺
*較為常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
*與反應(yīng)起始時RNA的總量及純度有關(guān)
*建議在試驗中加入對照RNA
**鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進行PCR擴增時，在總的反應(yīng)體系中的含量不要*過1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成,。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu),，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火,；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進行有效延伸,。
*目的mRNA中含有強的轉(zhuǎn)錄中止位點，可以試用以下方法解決：
a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃,。
b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行*鏈反應(yīng),。
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶,，則需要用DNase I重新處理樣品,。
*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果,。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火,，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
*由于mRNA剪切方式的不同,，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果,。
以上就是今天上海巴玖和大家分享的內(nèi)容，如果還想了解更多關(guān)于PCR儀的內(nèi)容或是有意向購買的顧客,，可以隨時上海巴玖,，巴玖會給您一個滿意的服務(wù)！