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 前言：我們實驗中,，標本中大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質,以及蛋白質為水溶性,，在用于研究之前,，常需固定,即使其凝固以降低其水溶性。甲醛能與蛋白質的氨基反應,，使蛋白質凝固,，因此在醫(yī)藥上可做檢驗時的組織固定劑、以及防腐劑等,。而在固定劑中,，zui常用的是多聚甲醛。

多聚甲醛染色前固定：
   做實驗的過程中,，因為排不上實驗儀器,、希望標本能夠較長時間存放等等原因，很多實驗人員習慣性都會用4％多聚甲醛預先固定標本,。也有為了滅活標本里面可能存在的微生物（細菌,、病毒等）,，起到安全保障作用,；或者是做胞內染色前的準備，進行固定細胞,。

  然而,，可能很多人忽視了一點，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定標本,，細胞表面有些位點在固定后構象發(fā)生改變,，使得抗體無法結合產生假陰性，也可能由于固定作用,，導致其它位點產生非特異性結合（假陽性）,。

   因此，知道哪些抗體染色前不能預固定,，十分重要,。

 

多聚甲醛染色后固定：
   染色后的固定，就與抗原構象關系不大了,，更多的是熒光素,。以前4色以內的時候，用的熒光素都是非串聯(lián)的,，因此大多數(shù)影響不大,，但隨著各種新型串聯(lián)染料的出現(xiàn)，多聚甲醛固定就成了問題了。

   事實上,，當您去搜索串聯(lián)染色標記（如PE-cy7,、APC-cy7等）的抗體時，會發(fā)現(xiàn)一些比較詳細的描述里面會注明,，用多聚甲醛固定過的樣本,，必須在4小時內檢測，否則容易導致串聯(lián)染料降解,，若要長時間保存,，還是需要洗滌后，轉移到不含多聚甲醛的緩沖液中,。

   需要注意的是,，做GFP熒光檢測的同學，也需要注意一下,，多聚甲醛固定也會影響GFP,，多聚甲醛固定后，并非使GFP熒光淬滅,，而是使GFP蛋白構象發(fā)生改變,，無法產生熒光。有時候您固定后檢測到的熒光可能是自發(fā)熒光,，或剩余的未被改變構象的GFP發(fā)出的,。

解決方案：
1、 如果檢測的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子,，請盡量不要預固定,，如需長期保存樣本，可以考慮凍存單個核細胞,。
2,、 如果檢測的是前述表格中不會受多聚甲醛影響的分子，可用1％多聚甲醛固定保存,，但FSC,、SSC和熒光強度影響較大。
3,、 如果希望在染色后保持較長時間熒光穩(wěn)定,，仍建議：避光4度，如果仍不放心,，可考慮購買商品化的適用于串聯(lián)染料的固定劑,。