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什么都能用多聚甲醛固定嗎?
閱讀：4628 發(fā)布時(shí)間：2017-7-19前言：我們實(shí)驗(yàn)中,，標(biāo)本中大多數(shù)神經(jīng)激素、肽類物質(zhì),以及蛋白質(zhì)為水溶性,，在用于研究之前,，常需固定,即使其凝固以降低其水溶性。甲醛能與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng),，使蛋白質(zhì)凝固,，因此在醫(yī)藥上可做檢驗(yàn)時(shí)的組織固定劑、以及防腐劑等,。而在固定劑中,，zui常用的是多聚甲醛,。
多聚甲醛染色前固定：
做實(shí)驗(yàn)的過程中,，因?yàn)榕挪簧蠈?shí)驗(yàn)儀器、希望標(biāo)本能夠較長(zhǎng)時(shí)間存放等等原因,，很多實(shí)驗(yàn)人員習(xí)慣性都會(huì)用4％多聚甲醛預(yù)先固定標(biāo)本,。也有為了滅活標(biāo)本里面可能存在的微生物（細(xì)菌、病毒等）,，起到安全保障作用,；或者是做胞內(nèi)染色前的準(zhǔn)備，進(jìn)行固定細(xì)胞,。
然而,，可能很多人忽視了一點(diǎn)，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定標(biāo)本,，細(xì)胞表面有些位點(diǎn)在固定后構(gòu)象發(fā)生改變,，使得抗體無(wú)法結(jié)合產(chǎn)生假陰性，也可能由于固定作用,，導(dǎo)致其它位點(diǎn)產(chǎn)生非特異性結(jié)合（假陽(yáng)性）,。
因此，知道哪些抗體染色前不能預(yù)固定,，十分重要,。
多聚甲醛染色后固定：
染色后的固定，就與抗原構(gòu)象關(guān)系不大了,，更多的是熒光素,。以前4色以內(nèi)的時(shí)候，用的熒光素都是非串聯(lián)的,，因此大多數(shù)影響不大,，但隨著各種新型串聯(lián)染料的出現(xiàn)，多聚甲醛固定就成了問題了。
事實(shí)上,，當(dāng)您去搜索串聯(lián)染色標(biāo)記（如PE-cy7,、APC-cy7等）的抗體時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)一些比較詳細(xì)的描述里面會(huì)注明,，用多聚甲醛固定過的樣本,，必須在4小時(shí)內(nèi)檢測(cè)，否則容易導(dǎo)致串聯(lián)染料降解,，若要長(zhǎng)時(shí)間保存,，還是需要洗滌后，轉(zhuǎn)移到不含多聚甲醛的緩沖液中,。
需要注意的是,，做GFP熒光檢測(cè)的同學(xué)，也需要注意一下,，多聚甲醛固定也會(huì)影響GFP,，多聚甲醛固定后，并非使GFP熒光淬滅,，而是使GFP蛋白構(gòu)象發(fā)生改變,，無(wú)法產(chǎn)生熒光。有時(shí)候您固定后檢測(cè)到的熒光可能是自發(fā)熒光,，或剩余的未被改變構(gòu)象的GFP發(fā)出的,。
解決方案：
1、 如果檢測(cè)的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子,，請(qǐng)盡量不要預(yù)固定,，如需長(zhǎng)期保存樣本，可以考慮凍存單個(gè)核細(xì)胞,。
2,、 如果檢測(cè)的是前述表格中不會(huì)受多聚甲醛影響的分子，可用1％多聚甲醛固定保存,，但FSC,、SSC和熒光強(qiáng)度影響較大。
3,、 如果希望在染色后保持較長(zhǎng)時(shí)間熒光穩(wěn)定,，仍建議：避光4度，如果仍不放心,，可考慮購(gòu)買商品化的適用于串聯(lián)染料的固定劑,。
