化工儀器網(wǎng)
公司動(dòng)態(tài)
細(xì)胞冷凍保存的具體操作步驟
閱讀：1335 發(fā)布時(shí)間：2014-4-1細(xì)胞冷凍保存的具體操作步驟
根據(jù)上海恒遠(yuǎn)技術(shù)部給出的細(xì)胞冷凍保存方法,，現(xiàn)公布于下：
細(xì)胞冷凍保存
1. 注意事項(xiàng)：
1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài),，約為80 – 90 %致密度。
1.2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生,。
1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22 micronFGLP flon 過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品,，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝,，4℃避光保存,，勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，以高壓蒸汽滅菌后避光保存,。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性,。 1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml 1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml,，細(xì)胞濃度不要太高，某些hybridoma 會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去,。 1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,，依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml,。 1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。
1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 % DMSO,，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時(shí),，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,，以防止冷凍失敗。
1.6. 冷凍方法： 1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10 分鐘---> -20℃ 30 分鐘---> -80℃ 16 - 18 小時(shí)(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。 1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以–1 ～ -3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃,，放在液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存,。
細(xì)胞冷凍保存
2. 材料： 2.1. 生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞 2.2. 新鮮培養(yǎng)基 2.3. DMSO (Sigma D-2650) 2.4. 無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020) 2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) 2.6. 血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片 2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)
3. 步驟： 3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。 3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中,，zui后濃度為5-10%,，混合均勻，置于室溫下待用,。 3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,，收集培養(yǎng)之細(xì)胞,，取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
3.4. 離心,，去除上清液,，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,，混合均勻,，分裝于已標(biāo)示*之冷凍保存管中，1 ml/vial,，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè),。 3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16～18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中,，再放入液氮槽中,。
四月新品優(yōu)惠中，咨詢訂購(gòu),！