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兔VX2腫瘤的離體培養(yǎng)及有關生物學特性
閱讀：1667 發(fā)布時間：2012-10-31在體外分離純化VX2腫瘤細胞,，觀察其生物學特性. 方法：采用組織塊法和消化法結合對兔VX2腫瘤進行原代培養(yǎng),體外傳代觀察,傳代40次并對培養(yǎng)細胞進行形態(tài) 學觀察,、細胞周期檢查,、核型分析,、兔及裸鼠移植. 結果：純化的兔VX2腫瘤細胞形態(tài)一致,，呈圓形、多角形的上皮細胞,體積小,核漿比倒置,體外連續(xù)培養(yǎng)8 mo,傳代50次以上,細胞倍增時間為26.4 h,細胞周期測定G1期為74.61%, G2期為7.78%, S期為17.6%. 染色體為亞三倍體核型,眾數為60條. 高細胞濃度可保證同種移植成瘤率,裸鼠移植可成瘤, 無支原體污染. 結論：兔VX2腫瘤細胞系來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的鱗狀上皮細胞惡性腫瘤,目前已經純化,，可應用于進一步腫瘤實驗研究.
【關鍵詞】 兔; 腫瘤細胞,培養(yǎng)的; 腫瘤標記,生物學 0引言 兔VX2腫瘤是來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的上皮細胞惡性腫瘤,，屬于鱗狀細胞癌，1940年建株［1］,，國內文獻對其來源描述不統(tǒng)一. 其特點可接種在兔體內,，具有較高的肺、肝轉移特性,，在大型動物模型的研究上具有很高的應用價值. 上一直沒有建成受到*并廣泛使用的VX2細胞系,，多數仍以組織塊方法保存. 為進一步進行離體研究，我們分離并純化了VX2瘤株,，并進行了生物學特性觀察.
1材料和方法
1.1材料新西蘭大白兔9只和BALB/c裸鼠均購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心,；原代培養(yǎng)所用腫瘤組織來源于本院液氮保存冰凍組織塊，于新西蘭大白兔腿部肌肉內接種并增殖. 胎牛血清（FBS, Gibco）,；培養(yǎng)瓶（Costar）,；RPMI 1640（Gibco）；24孔板（Nunc, Roskilde, Denmark）,；廣譜抗細胞角蛋白（PCK）混合型鼠抗兔mAb（Boster）,，廣譜抗細胞波形蛋白鼠抗豬mAb（福州邁新公司）；秋水仙素（西安山川公司）離心機（LD52A,，北京醫(yī)用離心機廠）,；其他試劑及儀器取自唐都醫(yī)院中心實驗室. 1.2方法 1.2.1腫瘤細胞的分離純化無菌摘取VX2腫瘤邊緣增殖活躍部分,用PBS液沖洗3次,在顯微鏡下剔除多余組織，剪成直徑0.5～1.0 mm左右的小塊,以2.5 g/L胰酶加1 g/L膠原酶于37℃消化20 min,，200目尼龍網過濾后800 r/min離心5 min,，取沉淀物培養(yǎng)，較低密度接種于6孔板. 組織塊貼壁接種于預先涂抹薄層FBS的培養(yǎng)瓶（Costar）瓶底,，瓶底朝上,，向瓶內加入含100 mL/L FBS和青鏈霉素雙 抗的RPMI 1640培養(yǎng)液5 mL,，置37℃，50 mL/L CO2,，飽和濕度的培養(yǎng)箱內, 2 h后緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉. 消化法第2日即見細胞生長. 組織塊法于第3日組織塊均浮起,，可見細胞生長. 于島狀生長的細胞處在倒置顯微鏡下無菌刮取，培養(yǎng),，取得多瓶純化細胞，其形態(tài),、生長速度基本一致. 待細胞成片生長,、占據大部分瓶底時即用2.5 g/L胰蛋白酶于37℃下消化傳代.
1.2.2形態(tài)學觀察分別取純化后第10代和50代的細胞進行細胞爬片、HE染色,、倒置顯微鏡鏡下觀察. 將VX2瘤接種于兔腿部肌肉,，待成瘤后切片光鏡下觀察. 1.2.3生長特性測定將第50代細胞以1×107/L的密度接種于24孔板，每孔加入含100 mL/L FBS的1640培養(yǎng)基0.5 mL,，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 每日同一時間用胰蛋白酶消化3孔細胞,，血球計數板進行計數，連續(xù)進行4 d,，繪制細胞生長曲線. 利用SPSS軟件指數函數擬合模型（Exponential）輔助計算細胞群體倍增時間［2］. 制作細胞爬片,，分別于貼壁后24，48,，72 h計算分裂指數. 1.2.4瓊脂集落形成率測定收集第52代細胞和相應的對照細胞,，制備含細胞的3.5 g/L瓊脂糖液，并加到7 g/L瓊脂糖凝膠上,，于37℃,，50 mL/L CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng). 3 wk后計算集落形成率.
1.2.5免疫細胞化學分析取第55代細胞爬片,，室溫下用1∶1混合的甲醇與丙酮將生長在蓋玻片上的細胞固定15～20 min,，分別應用PCK混合型鼠抗兔mAb及超敏加廣譜抗細胞波形蛋白鼠抗豬mAb行免疫組織化學染色，elisa試劑盒光學顯微鏡下觀察.
1.2.6染色體分析取處于80%匯合時的第60代細胞加入終濃度為0.3 mg/L的秋水仙素,，在37℃,，50 mL/L CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育5 h, 然后盡量吹打使阻斷于分裂中期的細胞脫壁,，將細胞懸液裝入10 mL離心管. 1100 r/min離心10 min,，去上清液，再向離心管中輕輕加入6 mL低滲鹽溶液75 mmol/L KCl,，37℃靜置30 min. 然后加入2 mL新鮮固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）預固定,，用移液管吹打調勻. 1100 r/min離心10 min，去上清液. 之后加入新鮮固定液8 mL,，輕輕吹打均勻,，離心10 min,；本步驟再重復2遍. 末次離心后，小心吸除大部分上清液,，余下0.5～1.0 mL固定液,，輕輕吹打調勻. 吸少量細胞懸液，滴落在-20℃預冷過的潔凈載玻片上,迅速在酒精燈火焰上烤干. 制備好的玻片立即用Giemsa染色. 顯微鏡下觀察染色后的標本,，統(tǒng)計其染色體數目. 1.2.7細胞周期測定用2.5 g/L胰蛋白酶加0.25 g/L EDTA消化培養(yǎng)細胞,，確保細胞盡可能打散，PRM 1640重懸后移至1.5 mL離心管中,， PBS離心清洗3遍后,，加入DPBS（Dulbeccos phosphate buffered saline）配制的750 mL/L冰乙醇，4℃固定2 h或過夜,，PBS再離心清洗1遍后用1 g/L RNase 37℃消化20～30 min,，DPBS離心清洗2遍，300目尼龍網過濾,，0.2～0.3 mL DPBS重懸,，PI染色5 min后流式細胞儀測定細胞周期.
1.2.8同種異體移植取第60～70代的對數生長期細胞，將新西蘭兔分為3組,，每組3只,，分別以1×109，1×1010,，1×1011個/L的細胞懸液4 mL接種于兔腿部肌肉,，觀察腫瘤在肌肉內的生長情況.
1.2.9裸鼠移植取第60～70代對數生長期細胞2×1011個/L,接種于3只BALB/c裸鼠腋窩皮下, 每只1 mL，觀察腫瘤在肌肉內的生長情況.
1.2.10支原體及致高鈣血癥能力檢測采用地依紅染色及肉湯培養(yǎng)法檢測培養(yǎng)液及細胞內支原體. 對成功接種VX2瘤的兔子進行耳緣靜脈采血,，檢測血清鈣離子濃度［3-4］.
1.2.11細胞系的維持,、凍存與復蘇取對數生長期細胞，用DHanks液漂洗3遍,，2.5 g/L胰蛋白酶加0.2 g/L EDTA消化細胞5 min,，收集細胞， 800 r/min離心5 min,，用1640培養(yǎng)液重懸細胞,，每瓶細胞分種3～5瓶，同時凍存適量細胞,，凍存液為培養(yǎng)液中加入100 mL/L血清及80 g/L二甲基亞砜,，放入液氮罐中保存. 將盛有VX2細胞的冷凍管（已冷凍保存1 mo）從液氮中取出，37℃水浴,，使細胞迅速融化,，將細胞懸液移入預溫至37℃、含有100 mL/L血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃,，50 mL/L CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，細胞的成活率大于80%. 2結果 2.1細胞形態(tài)zui初純化的細胞部分在相差顯微鏡下可見扇形細胞質（fanlike membranes）
經過一段時間傳代，細胞呈上皮樣細胞排列, 單層貼壁生長,有鋪路石征,，生長成團后即出現重疊生長現象,，細胞以多邊形為. HE染色見細胞輕度嗜堿,核大,核質比例異常, 細胞呈異型性明顯，可見較多核分裂象
2.2生長特性細胞生長于第3日達到高峰. 細胞倍增時間為26.4 h. 第55代細胞的生長曲線見圖4,，細胞分裂指數分別為：24 h,，1.9%；48 h,，7.0%,；72 h，9.3%. 雙層瓊脂形成率為22.1%. 圖1倒置顯微鏡下兔VX2腫瘤細胞呈扇形細胞質×400（略） 圖2傳代后倒置顯微鏡下兔VX2腫瘤細胞呈多邊形為主×100（略） 圖3兔VX2腫瘤細胞形態(tài) ×100（略）
2.3免疫組織化學染色細胞胞質中可見到PCK免疫組織化學染色弱陽性,，波紋蛋白染色陰性.
2.4染色體分析在100個分裂中期細胞中，染色體數目主要分布于57～62之間,，染色體眾數為60,，多為亞三倍體. 染色體有缺失、斷裂,、易位等結構異常.
2.5細胞周期分析流式細胞儀分析 結果顯示G0/G1：74.61%,； G2/M：7.78%； S：17.6%,； G2/G1：1.87,；DI：2.40. 圖4第55代細胞的生長曲線（略）
2.6同種異體移植及裸鼠移植以1×109個/L細胞密度接種的3只兔子均未成瘤；以1×1010個/L接種的有2只成瘤,，其中1只于3 wk后停止生長,，解剖后可見瘤體基本為豆渣樣壞死；以1×1011個/接種的有2只成瘤. 3只成功成瘤的兔子成瘤潛伏期約10 d,，分別于36,，38，45 d后衰竭死亡. 解剖后可見瘤體無包膜,，呈侵潤性生長,，中心豆渣樣壞死，多有大量膿血,，廣泛轉移,，與傳統(tǒng)組織塊接種法成瘤特點一致. 3只裸鼠均成瘤
兔VX2細胞裸鼠移植，可見后肢皮下有成瘤現象（略） 2.7支原體及致高鈣血癥能力檢測支原體檢測陰性. 動物在接種后1 wk化驗血鈣波動在2.1～2.5 mmol/L之間. 3討論 兔VX2腫瘤是世界上廣泛使用,、可在大型動物體內生長的惡性腫瘤,，常用于惡性腫瘤介入和射頻治療的研究［
3-5］及影像學研究和動物模型的建立
［6-7］，其*性是小型實驗動物腫瘤模型所*的. 國內經常采用部位命名法來命名VX2腫瘤，如兔VX2肝癌,，卻忽視了VX2瘤是乳頭瘤惡變而成的上皮來源的惡性腫瘤. 國外對于體外VX2細胞系的建立一直有爭議,，Osato等zui早與1967年體外培養(yǎng)的VX2細胞由于培養(yǎng)箱故障而丟失
［8］，Voelkel等
［9］建立了一株VX2細胞系,，活力成瘤能力低,，并且喪失了產生PGE2的能力，沒有受到*. 1982年Easty等
［10］建立了VX2細胞系,，與此同時瑞士的Rolf等也建立了該細胞株,，并與之有差異，而比較結果沒有報道,，細胞系也沒有廣泛應用. 1985年Georges等［11］發(fā)現了2種不同的VX2瘤株,，一種VX2R高表達角蛋白，僅能在裸鼠體內成瘤,，另一種VX2R低表達角蛋白,，成瘤能力強. Dabbous等［
12］1980年也曾發(fā)現3種形態(tài)不同的VX2細胞. 劉險峰等
［13］純化了一株高表達角蛋白，高成瘤能力的VX2瘤株. 本實驗純化的VX2瘤株形態(tài)學上與文獻［8,10,11］的報道結果相似,，致高鈣血癥能力檢測,，與Doppelt等［14-15］的結果相同，從角蛋白表達低,、接種后兔存活期短來看,，惡性程度比較高，但是成瘤能力較國內一些研究較弱. 我們還發(fā)現接種后有個別腫瘤自發(fā)性衰退的現象,，與Osato等報道的VX7瘤自發(fā)性衰退相似. 結合本實驗和國外的文獻報道,，考慮VX2自身可能發(fā)生一定程度的分化，這可能與VX2瘤在國內外多以冰凍組織塊法保存有關,，發(fā)生自發(fā)性衰退和惡性程度減低的細胞必然在傳代的過程中淘汰,，因此懷疑VX2的惡性程度略有增高的可能性大，但是VX2腫瘤的基本性質沒有變化,，仍然是一株具有很高實用價值的應用與大型實驗動物的腫瘤細胞. 1988年VX2瘤株從日本傳入我校以來,，一直主要以液氮冷凍組織塊和動物體內傳代結合的方法保存，為進行進一步體外研究,，我們純化了該細胞系,，經過長時間傳代，性質穩(wěn)定,，可用于體外實驗. 實驗中發(fā)現的低細胞數量下成瘤能力下降和自發(fā)性消退現象,，其原因尚需進一步研究.