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瞬時轉(zhuǎn)染到293 T細胞
閱讀：2673 發(fā)布時間：2012-10-10瞬時轉(zhuǎn)染到293 T細胞
目的
瞬時轉(zhuǎn)染到293 T細胞是一種方便的方式過度和兩個細胞和細胞外（分泌或膜）蛋白。293是人類腎上皮細胞,，腺病毒轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)品,。293 T是導(dǎo)數(shù)也表達SV4 0大T抗原,，使游離復(fù)制質(zhì)粒含有SV4 0的起源和早期啟動子區(qū)域,。他們（兩個）有不尋常的財產(chǎn)被高度transfectable由以下磷酸鈣（磷酸）2transfection協(xié)議,。高達50%的效率是可以實現(xiàn)的,。
材料
•*培養(yǎng)液（高血糖）：補充瓦特/ 10%總線（無論是瓦特/或瓦特/熱滅活在55°℃/分鐘）,，非必需氨基酸，na-pyruvate,，和谷氨酰胺（筆/ streptmycin：可選）
•轉(zhuǎn)染試劑：
我）200 CaCl 2：2米水,，過濾消毒，儲存在4攝氏°
二）x2hbs：8.0克氯化鈉,，氯化鉀0.37g,，201mg（是的！毫克）2HPO 4•無水,，用葡萄糖,，5克/毫升培養(yǎng)基（調(diào)整PH值7.05氫氧化鈉和過濾消毒，儲存在4攝氏°）
•脫氧核糖核酸試劑盒提取成績好,。溶液中電子兼容,。基本上，沒有必要將脫氧核糖核酸,。
程序
培養(yǎng)條件
增長將很快,。通常倍增時間< 1天的觀察。分裂細胞4天,，每3 ~ 10至1 : 20稀釋和文化下5%的二氧化碳,。細胞松散連接，所以你可以分離細胞與ED TA單獨但短暫的胰蛋白酶消化為單懸,。不overtreat胰蛋白酶,。
轉(zhuǎn)染293細胞
以下的協(xié)議是10厘米的菜（中：10毫升）。如果你使用6孔或12孔板,，總體積的介質(zhì)應(yīng)3毫升和一點五毫升,，分別，和數(shù)額減少每個試劑因此,。
1,。細胞的前一天晚上給60 - 70 %融合在一天的轉(zhuǎn)染。如果達到100%的效率也會降低總匯,。小于50%融合可能確定但數(shù)額蛋白表達會很低,，因為少量的細胞,。
2。一小時前的轉(zhuǎn)染,，改中含有25µ米氯喹（從中國股票在公共電視網(wǎng),，儲存在- 20攝氏°）。量應(yīng)該是10毫升每碟,。（氯喹可以省略,，但效率提高約10）
3。添加10µ克基因ddh2o（1095µ我總）在15毫升無菌試管,，然后添加155µ我200氯化鈣。當(dāng)你準備好后,，加入1250µ升2xhbs滴輕輕攪拌,。添加此混合物直接向細胞滴通過介質(zhì)。做在1 - 2分鐘后加入2xhbs,。你會發(fā)現(xiàn)中變成橙色,。確保你均勻灑滴在整個地區(qū)。
4,。培養(yǎng)7 - 11小時很細,，可見粉塵狀沉淀。孵化后,，沖洗一次,，變化中又無氯喹，10 ml /碟,。
5,。收獲細胞，或培養(yǎng)上清液中,，轉(zhuǎn)染后48至72小時,。分泌蛋白，可以改變你的媒體（3天或4,，節(jié)省收集增刊）并給它一個3 - 4天的文化,。只要細胞還活著，他們生產(chǎn)的蛋白質(zhì),。然而,，當(dāng)時的分泌水平達到zui大值之間的差異蛋白質(zhì)。