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電泳技術(shù)
閱讀：1131 發(fā)布時間：2012-9-18電泳法,，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙,、醋酸纖維素,、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中,，于電場的作用下,，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶,，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法,。
電泳技術(shù)的基本原理和分類
在電場中，推動帶電質(zhì)點運動的力（F）等于質(zhì)點所帶凈電荷量（Q）與電場強度（E）的乘積,。F＝QE質(zhì)點的前移同樣要受到阻力（F）的影響,，對于一個球形質(zhì)點，服從Stoke定律,，即：F′＝6πrην式中r為質(zhì)點半徑,，η為介質(zhì)粘度，ν為質(zhì)點移動速度,，當質(zhì)點在電場中作穩(wěn)定運動時：F＝F′即QE＝6πrην
可見,，球形質(zhì)點的遷移率，首先取決于自身狀態(tài),，即與所帶電量成正比,，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外,，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點的電泳遷移率,。
電泳法可分為自由電泳（無支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。前者包括Tise-leas式微量電泳,、顯微電泳,、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳,。區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）,、薄層電泳（薄膜及薄板）、凝膠電泳（瓊脂,、瓊脂糖,、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等,。
自由電泳法的發(fā)展并不迅速,，因為其電泳儀構(gòu)造復(fù)雜、體積龐大,，操作要求嚴格,，價格昂貴等,。而區(qū)帶電泳可用各種類型的物質(zhì)作支持體，其應(yīng)用比較廣泛,。本節(jié)僅對常用的幾種區(qū)帶電泳分別加以敘述,。
影響電泳遷移率的因素
⒈電場強度 電場強度是指單位長度（cm）的電位降,，也稱電勢梯度,。如以濾紙作支持物，其兩端浸入到電極液中,，電極液與濾紙交界面的紙長為20cm,，測得的電位降為200V，那么電場強度為200V/20cm＝10V/cm,。當電壓在500V以下,，電場強度在2-10v/cm時為常壓電泳。電壓在500V以上,，電場強度在20-200V/cm時為高壓電泳,。電場強度大，帶電質(zhì)點的遷移率加速,，因此省時,，但因產(chǎn)生大量熱量，應(yīng)配備冷卻裝置以維持恒溫,。
?、踩芤旱?/font>pH值 溶液的pH決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。例如蛋白質(zhì)分子,，它是既有酸性基團（-COOH）,，又有堿性基團（-NH2）的兩性電解質(zhì)，在某一溶液中所帶正負電荷相等,，即分子的凈電荷等于零,，此時，蛋白質(zhì)在電場中不再移動,，溶液的這一pH值為該蛋白質(zhì)的等電點（isoelctric point,，pI）。若溶液pH處于等電點酸側(cè),，即pH＜pl,，則蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場中向負極移動,。若溶液pH處于等電點堿側(cè),，即pH＞pl，則蛋白質(zhì)帶負電荷，向正極移動,。溶液的pH離pl越遠,，質(zhì)點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大,。因此在電泳時，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì),，選擇合適的pH值緩沖液,。
⒊溶液的離子強度 電泳液中的離子濃度增加時會引起質(zhì)點遷移率的降低,。其原因是帶電質(zhì)點吸引相反符合的離子聚集其周圍,，形成一個與運動質(zhì)點符合相反的離子氛（ionic atmosphere），離子氛不僅降低質(zhì)點的帶電量,，同時增加質(zhì)點前移的阻力,，甚至使其不能泳動。然而離子濃度過低,，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量,，不易維持溶液的pH值，影響質(zhì)點的帶電量,，改變泳動速度,。離子的這種障礙效應(yīng)與其濃度和價數(shù)相關(guān)?？捎秒x子強度I表示,。
⒋電滲 在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲（electro-osmosis）,。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔,，且?guī)в锌山怆x的化學基團，因此常吸附溶液中的正離子或負離子,，使溶液相對帶負電或正電,。如以濾紙作支持物時，紙上纖維素吸附OH-帶負電荷,，與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H3O+,，帶正電荷移向負極，若質(zhì)點原來在電場中移向負極,，結(jié)果質(zhì)點的表現(xiàn)速度比其固有速度要快,，若質(zhì)點原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢,，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響,。
電泳分析常用方法
（一）醋酸纖維素薄膜電泳
醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯,。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜,。這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能*消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象,，又因為膜的親水性比較小,，它所容納的緩沖液也少，電泳時電流的大部分由樣品傳導(dǎo),，所以分離速度快,，電泳時間短，樣品用量少,，5μg的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果,。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。
醋酸纖維素膜經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存,。
?、辈牧吓c試劑 醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩沖液為pH8.6的巴比妥緩沖液,，濃度在0.05-0.09mol/L,。
⒉操作要點
?、拍さ念A(yù)處理：必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液,，浸透后，取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液,，不可吸得過干,。
⑵加樣：樣品用量依樣品濃度,、本身性質(zhì),、染色方法及檢測方法等因素決定。對血清蛋白質(zhì)的常規(guī)電泳分析,，每cm加樣線不超過1μl,，相當于60-80μg的蛋白質(zhì)。
?、请娪荆嚎稍谑覝叵逻M行,。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬,。
?、热旧阂话愕鞍踪|(zhì)染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑,，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色,。
⑸脫色與透明：對水溶性染料zui普遍應(yīng)用的脫色劑是5％醋酸水溶液。為了長期保存或進行光吸收掃描測定,，可浸入冰醋酸：無水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中,。
（二）凝膠電泳
以淀粉膠,、瓊脂或瓊脂糖凝膠,、聚丙烯酰胺凝膠等作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳法稱為凝膠電泳。其中聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,，PAGE）普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸,。瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用,，但適用于分離同工酶及其亞型，大分子核酸等應(yīng)用較廣,，介紹如下：
?、杯傊悄z電泳的原理概述 瓊脂糖是由瓊脂分離制備的鏈狀多糖。其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖,。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束,，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。因此該凝膠適合于免疫復(fù)合物,、核酸與核蛋白的分離,、鑒定及純化。在臨床生化檢驗中常用于LDH,、CK等同工酶的檢測,。
⒉瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的基本技術(shù) 在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中,，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對數(shù)成反比,；分子構(gòu)型也對遷移率有影響，如共價閉環(huán)DNA＞直線DNA＞開環(huán)雙鏈DNA,。當凝膠濃度太高時,，凝膠孔徑變小，環(huán)狀DNA（球形）不能進入膠中,，相對遷移率為0,，而同等大小的直線DNA（剛性棒狀）可以按長軸方向前移，相對遷移率大于0,。
?、旁O(shè)備與試劑：瓊脂糖凝膠電泳分為垂直及水平型兩種。其中水平型可制備低濃度瓊脂糖凝膠,，而且制膠與加樣都比較方便,，故應(yīng)用比較廣泛。核酸分離一般用連續(xù)緩沖體系，常用的有TBE（0.08mol/L Tris·HCl,，pH8.5,，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/L EDTA）和THE（0.04mol/L Tris·HCl,。pH7.8,，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/L EDTA）,。
?、颇z制備：用上述緩沖液配制0.5％-0.8％瓊脂糖凝膠溶液，沸水浴或微波爐加熱使之融化,，冷至55℃時加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5μg/ml,，然后將其注入玻璃板或有機玻璃板組裝好的模子中，厚度依樣品濃度而定,。注膠時,，梳齒下端距玻璃板0.5-1.0mm，待脫凝固后,，取出梳子,，加入適量電極緩沖液使板膠浸沒在緩沖液下1mm處。
?、菢悠分苽渑c加樣：溶解于TBE或THE內(nèi)的樣品應(yīng)含指示染料（0.025％溴酚藍或桔黃橙）,、蔗糖（10％-15％）或甘油（5％-10％），也可使用2.5％Fico Ⅱ增加比重,，使樣品集中,，每齒孔可加樣5-10μg。
?、入娪荆阂话汶妷簽?/font>5-15V/cm,。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程在低溫條件下進行,。
?、蓸悠坊厥眨弘娪窘Y(jié)束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進行回收,，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區(qū)帶的凝膠,，將其裝入透析袋（內(nèi)含適量新鮮電泳緩沖液），扎緊透析袋后,，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩沖液中,，100V電泳2-3小時，然后正負電極交換,，反向電泳2分鐘,，使透析袋上的DNA釋放出來,。吸出含DNA的溶液，進行酚抽提,、乙醇沉淀等步驟即可完成樣品的回收,。
其它還有低融點瓊脂糖法、醋酸銨溶液浸出法,、冷凍擠壓法等,，但各種方法都僅僅有利于小分子量DNA片段（＜1kb）的回收，隨著DNA分子量的增大,，回收量顯著下降,。
（三）等電聚焦電泳技術(shù)
等電聚焦（isoelectric focusing,，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù),。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質(zhì)組分,。
?、?/font>IEF的基本原理 在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極,，pH值逐漸增大,。如前所述,，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點的特征,，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動,，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點（pl）,。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動,，直到它們的等電點上聚焦為止,。可見在該方法中,，等電點是蛋白質(zhì)組分的特性量度,，將等電點不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后,，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上,，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。
?、?/font>pH梯度的組成 pH梯度的組成方式有二種,，一種是人工pH梯度，由于其不穩(wěn)定,，重復(fù)性差,，現(xiàn)已不再使用,。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質(zhì)的混合物,，在正吸入酸液,，如硫酸、磷酸或醋酸等,，在負引入堿液,，如氫氧化鈉、氨水等,。電泳開始前兩性電解質(zhì)的混合物pH為一均值,，即各段介質(zhì)中的pH相等，用pH0表示,。電泳開始后,，混合物中pHzui低的分子，帶負電荷zui多,，pI1為其等電點,，向正極移動速度zui快，當移動到正極附近的酸液界面時,，pH突然下降,，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動而停留在此區(qū)域內(nèi),。由于兩性電解質(zhì)具有一定的緩沖能力,，使其周圍一定的區(qū)域內(nèi)介質(zhì)的pH保持在它的等電點范圍。pH稍高的第二種兩性電解質(zhì),，其等電點為pI2,，也移向正極，由于pI2＞pI1,，因此定位于*種兩性電解質(zhì)之后,，這樣，經(jīng)過一定時間后,，具有不同等電點的兩性電解質(zhì)按各自的等電點依次排列,，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度,，如圖16-3所示,。
⒊兩性電解質(zhì)載體與支持介質(zhì) 理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo),，前者保證pH梯度的穩(wěn)定,，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個體系的電導(dǎo)均勻,。兩性電解質(zhì)的分子量要小,，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開,，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性。
常用的pH梯度支持介質(zhì)有聚丙烯酰胺凝膠,、瓊脂糖凝膠,、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為zui常應(yīng)用,。
電泳后,，不可用染色劑直接染色，因為常用的蛋白質(zhì)染色劑也能和兩性電解質(zhì)結(jié)合,，因此應(yīng)先將凝膠浸泡在5％的三氯醋酸中去除兩性電解質(zhì),，然后再以適當?shù)姆椒ㄈ旧?/font>
（四）其他
?、?/font>IEF/SDS-PAGE雙向電泳法 1975年O′Farrall等人根據(jù)不同組份之間的等電點差異和分子量差異建立了IEF/SD S-PAGE雙向電泳,。其中IEF電泳（管柱狀）為*向，SDS-PAGE為第二向（平板）,。在進行*向IEF電泳時,，電泳體系中應(yīng)加入高濃度尿素、適量非離子型去污劑NP-40,。蛋白質(zhì)樣品中除含有這兩種物質(zhì)外還應(yīng)有二硫蘇糖醇以促使蛋白質(zhì)變性和肽鏈舒展,。
IEF電泳結(jié)束后，將圓柱形凝膠在SDS-PAGE所應(yīng)用的樣品處理液（內(nèi)含SDS,、β-巰基乙醇）中振蕩平衡,，然后包埋在SDS-PAGE的凝膠板上端，即可進行第二向電泳,。
IEF/ SDS-PAGE雙向電泳對蛋白質(zhì)（包括核糖體蛋白,、組蛋白等）的分離是極為精細的,，因此特別適合于分離細菌或細胞中復(fù)雜的蛋白質(zhì)組分,。
⒉毛細管電泳 Neuhoff等人于1973年建立了毛細管均一濃度和梯度濃度凝膠用來分析微量蛋白質(zhì)的方法,，即微柱膠電泳,，均一濃度的凝膠是將毛細管浸入凝膠混合液中，使凝膠充滿總體積的2/3左右,，然后將其撳入約厚2mm的代用粘土墊上,，封閉管底，用一支直徑比盛凝膠的毛細管更細的硬質(zhì)玻璃毛細管吸水鋪在凝膠上,。聚合后,，除去水層并用毛細管加蛋白質(zhì)溶液（0.1-1.0μl，濃度為1-3mg/ml）于凝膠上,，毛細管的空隙用電極緩沖液注滿,，切除插入粘土部分,，即可電泳。
目前毛細管電泳分析儀的誕生,，特別是美國生物系統(tǒng)公司的電泳色譜儀為DNA片段,、蛋白質(zhì)及多肽等生物大分子的分離、回收提供了快速,、有效的途徑,。電泳色譜法是將凝膠電泳解析度和快速液相色譜技術(shù)溶為一體，在從凝膠中洗脫樣品時,，連續(xù)的洗脫液流載著分離好的成分,，通過一個連機檢測器，將結(jié)果顯示并打印記錄,。電泳色譜法既具有凝膠電泳固有的高分辨率,，生物相容性的優(yōu)點，又可方便地連續(xù)洗脫樣品,。
各電泳法,，除另有規(guī)定外，照下述方法操作,。
一,、紙電泳法 1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。 常用的水平式電泳室裝置如圖,，包括兩個電泳槽A和一個可以密封的玻璃（或相應(yīng)材料）蓋B,；兩側(cè)的電泳槽均用有機玻璃（或相應(yīng)材料）板C分成兩部分；外格裝有鉑電極（直徑0.5～0.8cm）D,；里格為可放濾紙E的有機玻璃電泳槽架F,，此架可從槽中取出；兩側(cè)電泳槽A內(nèi)的鉑電極D經(jīng)隔離導(dǎo)線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連,。 電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源,，常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般在500～10 000V,。
2. 操作法 （1） 電泳緩沖液 枸櫞酸鹽緩沖液（pH3.0） 取枸櫞酸 （C6H8O7·H2O）39.04g與枸櫞酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O）4.12g,，加水4000ml，使溶解,。 （2） 濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜,，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,，備用,。可按需要裁成長27cm,、寬18cm的濾紙,，或根據(jù)電泳室的大小裁剪,，并在距長度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號備點樣用,?！?（3） 點樣 有濕點法和干點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH3.0）中,，濕潤后,，取出，用濾紙吸干多余的緩沖液,，置電泳槽架上,，使起始線靠近陰，將濾紙兩端浸入緩沖液中,，然后用微量注射器精密點加供試品溶液,，每點10μl,共3點，并留2個空白位置,。 干點法是將供試品溶液點于濾紙上,，吹干、再點,，反復(fù)數(shù)次,，直至點完規(guī)定量的供試品溶液，然后用噴霧器將濾紙噴濕,，點樣處zui后噴濕,，本法適用于稀的供試品溶液。 （4） 電泳 于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒鉑電極,，接通電泳儀穩(wěn)壓電源擋,調(diào)整電壓梯度為18～20V/cm,，電泳約1小時45分鐘，取出,立即吹干,置紫外光燈（254nm）下檢視,，用鉛筆劃出紫色斑點的位置,。 （5） 含量測定 剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條,，分別置試管中,，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml,，搖勻,，放置1小時，用3號垂熔玻璃漏斗濾過,，也可用自然沉降或離心法傾取上清液,，按各藥品項下的規(guī)定測定吸收度，并按吸收系數(shù)計算含量,。
二,、醋酸纖維素薄膜電泳法 1.儀器裝置 電泳室及直流電源同紙電泳,。
2.試劑 （1） 巴比妥緩沖液（pH8.6）取巴比妥2.76g，巴比妥鈉15.45g,，加水溶解使成1000ml,。 （2） 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中,。 （3） 漂洗液 取乙醇45ml,、冰醋酸5ml及水50ml，混勻,。 （4） 透明液 取冰醋酸25ml,，加無水乙醇75ml，混勻,。 3.操作法 （1） 醋酸纖維素薄膜 取醋酸纖維素薄膜,，裁成2cm×8cm的膜條，將無光澤面向下,，浸入巴比妥緩沖液（pH8.6）中,待*浸透,，取出夾于濾紙中，輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經(jīng)濾紙橋浸入巴比妥緩沖液（pH8.6）中,。 （2） 點樣與電泳 于膜條上距負2cm處,，條狀滴加蛋白含量約5％的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區(qū)帶距離以4～5cm為宜,。 （3） 染色 電泳完畢,，將膜條取下浸于氨基黑染色液中，2～3分鐘后,，用漂洗液浸洗數(shù)次,，直至脫去底色為止。 （4） 透明 將洗凈并*干后的膜條浸于透明液中10～15分鐘,，取出平鋪于潔凈的玻板上,，干后即成透明薄膜，可于分光光度計上測定和作標本長期保存,。 （5） 含量測定 未經(jīng)透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規(guī)定的方法測定,，一般采用洗脫法或掃描法，測定各蛋白質(zhì)組分的相對百分含量,。 洗脫法 將洗凈的膜條用濾紙吸干,，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區(qū)帶，分別浸于1.6％的氫氧化鈉溶液中,，振搖數(shù)次,，至洗脫*， 于一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應(yīng)的無蛋白部位,，同法操作作對照,。先計算吸收值總和，再計算各蛋白組分所占百分率,。 掃描法 將干燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過反射 （未透明薄膜） 或透射（已透明薄膜）方式在記錄器上自動繪出各蛋白組分曲線圖,，橫坐標為膜條的長度，縱坐標為吸收度,，計算各蛋白組分的百分含量,。亦可用微機處理積分計算。
三,、瓊脂糖凝膠電泳法 1.儀器裝置 電泳室及直流電源同紙電泳,。
2.試劑 （1） 醋酸－鋰鹽緩沖液（pH3.0） 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后,，用氫氧化鋰調(diào)節(jié)pH至3.0,，再加水至1000ml。 （2） 甲苯胺藍溶液 取甲苯胺藍0.1g,，加水100ml使溶解,。 3.操作法 （1）制膠 取瓊脂糖約0.2g，加水10ml,，置水浴中加熱使溶脹*,加溫熱的醋酸－鋰鹽緩沖液（pH3.0）10ml,，混勻，趁熱將膠液涂布于大小適宜（2.5cm×7.5cm或4cm×9cm）的玻璃板上,，厚度約3mm,，靜置，待凝膠結(jié)成無氣泡的均勻薄層,，即得,。 （2） 標準品溶液及供試品溶液的制備 照各藥品項下規(guī)定配制。 （3） 點樣與電泳 在電泳槽內(nèi)加入醋酸－鋰鹽緩沖液（pH3.0）,將凝膠板置于電泳槽架上,，經(jīng)濾紙橋浸入緩沖液,。于凝膠板負分別點樣1μl，立即接通電源,，在電壓梯度約30V/cm,，電流強度1～2mA/cm的條件下，電泳約20分鐘,，關(guān)閉電源,。 （4） 染色與脫色 取下凝膠板，用甲苯胺藍溶液染色,，用水洗去多余的染色液至背景無色為止,。
四,、聚丙烯酰胺凝膠電泳法 1.儀器裝置 通常由穩(wěn)流電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成,。其電泳室有上,、下兩槽,每個槽中都有固定的鉑電極，鉑電極經(jīng)隔離電線接于電泳儀穩(wěn)流擋上,。
2.試劑 （1）溶液A 取三羥甲基氨基甲烷36.6g,，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml，再加水溶解并稀釋至100ml,置棕色瓶內(nèi),，在冰箱中保存,。 （2）溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基雙丙烯酰胺0.74g,，加水溶解并稀釋至100ml,濾過,，置棕色瓶內(nèi)，在冰箱中保存,。 （3）電極緩沖液（pH8.3） 取三羥甲基氨基甲烷6g,、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀釋至1000ml，置冰箱中保存,，用前稀釋10倍,。 （4）溴酚藍指示液 取溴酚藍0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90％乙醇5ml,微熱使溶解，加20％乙醇制成250ml,。 （5）染色液 取0.25％（W/V）考馬斯亮藍G<[250]>溶液2.5ml,，加12.5％（W/V）三氯醋酸溶液至10ml。 （6）稀染色液 取上述染色液2ml,，加12.5％（W/V）三氯醋酸溶液至10ml,。 （7）脫色液 7％醋酸溶液。
3.操作法 （1）制膠 取溶液A2ml,，溶液B5.4ml,，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml,，混勻,，抽氣趕去溶液中氣泡， 加0.56％過硫酸銨溶液2ml,，混勻制成膠液,，立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管（10×0.5cm）中,使膠層高度達6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面,，管底氣泡必須趕走,，靜置約30分鐘，待出現(xiàn)明顯界面時即聚合完畢,，吸去水層,。 （2）標準品溶液及供試品溶液的制備 照各藥品項下的規(guī)定。 （3）電泳 將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內(nèi)，每管加供試品或標準品溶液50～100μl,，為防止擴散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚藍指示液1滴,也可直接在上槽緩沖液中加0.04％溴酚藍指示液數(shù)滴,，玻璃管的上部用電極緩沖液充滿，上端接負極,、下端接正極,。調(diào)節(jié)起始電流使每管為1mA，數(shù)分鐘后,，加大電流使每管為2～3mA,，當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處，關(guān)閉電源,。 （4）染色和脫色 電泳完畢,，用裝有長針頭并吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內(nèi)滑出,，將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10～30分鐘,，以水漂洗干凈，再用脫色液脫色至無蛋白區(qū)帶凝膠的底色透明為止,。 （5）結(jié)果判斷 將膠條置燈下觀察,，根據(jù)供試品與標準品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。 相對遷移率 供試品和標準品的電泳區(qū)帶有時可用相對遷移率（R'<[m]>）進行比較,。其計算式如下： 進膠端到供試品或標準品區(qū)帶的距離 相對遷移率（R'<[m]>）＝──
進膠端到溴酚藍區(qū)帶的距離 掃描 將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描并積分,，由各組分的峰面積計算百分含量。
五,、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白分子量,是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）按重量比結(jié)合成復(fù)合物,使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的負電荷,，消除了不同蛋白分子的電荷效應(yīng),使蛋白分子相對遷移率（R'<[m]>）的大小*取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標準蛋白的對數(shù)和相對遷移率所作的標準曲線中求出供試品的分子量,。
1.儀器裝置 除另有規(guī)定外,，同聚丙烯酰胺凝膠電泳。
2.試劑 （1）丙烯酰胺液溶 稱取丙烯酰胺22.2g與雙丙烯酰胺0.6g,， 溶于100ml水中,，貯于褐色瓶中低溫保存。 （2） 凝膠緩沖液 稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）8.82g ,、磷酸氫二鈉（Na2HPO4 ·12H2O）51.55g與十二烷基硫酸鈉2.0g,，加水至1000ml（若有沉淀析出,可加溫至37℃溶解）。 （3）電泳緩沖液 將凝膠緩沖液稀釋1倍,。 （4）染色液 稱取25mg考馬斯亮藍R<[250]>,溶于57％乙醇與9.2％醋酸混合液100ml中,。 （5）脫色液 取無水乙醇75ml，加冰醋酸50ml,，用水稀釋至1000ml,。
3.操作法 除下列規(guī)定外,，其他均同聚丙烯酰胺凝膠電泳。 （1）制膠 用丙烯酰胺溶液－凝膠緩沖液－水－1.6％過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺（需冷卻）（10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045） 配制而成,。 （2）標準蛋白溶液及供試品溶液的制備 取標準蛋白,，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，與水解液（取尿素21.6g和十二烷基硫酸鈉0.04g,，溶于40ml水中）1∶3混合,，置冰箱中過夜,。供試品照上述方法配制,。 （3）電泳 調(diào)節(jié)電流使每管為8mA。
4.相對遷移率和分子量計算 將電泳脫色后的區(qū)帶用卡尺或用掃描定位法測量染料移動的距離,、染色前膠條長度,、蛋白移動距離和脫色后的膠條長度。按下式計算相對遷移率： 蛋白移動的距離 染色前的膠條長度 相對遷移率（R'<[m]>）＝───×─── 脫色后的膠條長度 染料移動的前沿距離 以R'<[m]>為橫坐標,已知分子量標準蛋白的對數(shù)為縱坐標,在半對數(shù)坐標紙上繪圖,由標準曲線中查出供試品分子量,。