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細胞色素C的制備及含量,、活力測定
閱讀：2187 發(fā)布時間：2012-9-11
一、實驗?zāi)康?/strong>
（1）通過細胞色序C的制備,，了解制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和步驟
（1）通過細胞色序C的制備,，了解制備蛋白質(zhì)制品的一般原理和步驟
（2）掌握制備細胞色素C的操作技術(shù)及含量的測定方法
二,、實驗原理
細胞色素是一類含有鐵 啉基團的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細胞中,。細胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用,。細胞色C （cytochrome c） 是細胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B 和細胞色素氧化酶之間,，是呼吸鏈的一個重要組成部分,。每分子細胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細胞色素C結(jié)晶,，并已對100多種細胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行了測定,。結(jié)果表明，細胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間,；不同來源細胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異,。細胞色素C中賴氨酸含量較高，等電點為10.7,，含鐵量為0.38%~0.43%,，Mr為12000~13000,，豬心細胞色素C分子量12200。細胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白,，它易溶于水及酸性溶液,，故常用酸性水提取。細胞色素C分為氧化型和還原型兩種,，氧化型水溶液呈深紅色,，還原型水溶液呈桃紅色,。細胞色素C對熱比較穩(wěn)定,，不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘,，細胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,，若增加加熱時間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高,。細胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定,，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細胞色素C制成還原型的,，因為比較穩(wěn)定并易于保存,。
細胞色素是一類含有鐵 啉基團的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細胞中,。細胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用,。細胞色C （cytochrome c） 是細胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B 和細胞色素氧化酶之間,，是呼吸鏈的一個重要組成部分,。每分子細胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細胞色素C結(jié)晶,，并已對100多種細胞色素C蛋白的一級結(jié)構(gòu)進行了測定,。結(jié)果表明，細胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間,；不同來源細胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異,。細胞色素C中賴氨酸含量較高，等電點為10.7,，含鐵量為0.38%~0.43%,，Mr為12000~13000,，豬心細胞色素C分子量12200。細胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白,，它易溶于水及酸性溶液,，故常用酸性水提取。細胞色素C分為氧化型和還原型兩種,，氧化型水溶液呈深紅色,，還原型水溶液呈桃紅色,。細胞色素C對熱比較穩(wěn)定,，不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘,，細胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%,，若增加加熱時間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高,。細胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定,，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細胞色素C制成還原型的,，因為比較穩(wěn)定并易于保存,。
三、試劑與器材
絞肉機,、電磁攪拌器,、離心機、分光光度計,、玻璃柱,、下口瓶、燒杯等,。
絞肉機,、電磁攪拌器,、離心機、分光光度計,、玻璃柱,、下口瓶、燒杯等,。
四,、操作方法
材料處理—提取—中和—吸附—洗脫—鹽析—沉淀—透析—測定
材料處理—提取—中和—吸附—洗脫—鹽析—沉淀—透析—測定
五、關(guān)鍵步驟與注意事項
① 吸附前必須把人造沸石處理好,裝柱時避免柱內(nèi)出現(xiàn)氣泡,沿柱壁緩緩流入柱內(nèi),。
② 洗脫時洗脫液一旦變白,，立刻停止收集。洗脫完畢人造沸石可再生使用,。