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細(xì)胞組分的分析方法——線粒體的分離與觀察
閱讀：5458 發(fā)布時間：2012-9-5
用差速離心法分離動,、植物細(xì)胞線粒體。
線粒體（mitochondria）是真核細(xì)胞*的,，司能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器,。細(xì)胞中的能源物質(zhì)——脂肪、糖,、部分氨基酸在此進行zui終的氧化,，并通過藕聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細(xì)胞生理活動之需,。對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的,。
制備線粒體采用組織勻漿懸液介質(zhì)中進行差速離心的方法。在一給定的離心場中（對于所使用的離心機,，就是選用一定的轉(zhuǎn)速）,，球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度,。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間內(nèi),，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小,、輕重分批沉降在離心管底部,，從而分批收集。細(xì)胞器中zui先沉淀的是細(xì)胞核,，其次是線粒體,，其它更輕的細(xì)胞器和大分子可依次在分離。
懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液,，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相,，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2的條件下,，亞細(xì)胞組分不容易重新聚集，有利于分離,。整個操作過程應(yīng)注意使樣品保持4℃,，避免酶失活。
線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法,。詹納斯綠B（Janus green B）是對線粒體專一的活細(xì)胞染料,，毒性很小，屬于堿性染料,，解離后帶正電,，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色,，而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無色,。
（一）、材料
大鼠肝臟
（二）,、試劑
1．生理鹽水,。
2．1％詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制,。
3．0．25mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4）：
0．1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris） 10ml
0．1 mol/L鹽酸 8．4ml
加重蒸水到 100ml
加蔗糖到0.25 mol/L,。蔗糖為密度梯度離心用D（+）蔗糖
4．0．34mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4）
5．固定液：甲醇—冰醋酸（9：1）
6．姬姆薩染液：Giemsa粉0．5g，甘油33ml,，純甲醇33ml,。先往Giemsa粉中加少量甘油在研缽內(nèi)研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻,，56℃左右保溫2h令其充分溶解,，zui后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液,，保存于棕色瓶,。用時吸出少量用1/15mol/L磷酸鹽緩沖液作10～20倍稀釋。
1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6．8）：
1/15 mol/L KH2PO4 50ml
1/15 mol/L Na2HPO4 50ml
（三）、器材
高速離心機,、解剖刀剪,、小燒杯、冰浴,、漏斗,、尼龍織物、玻璃勻漿器,。
1．制備大鼠肝細(xì)胞勻漿,。實驗前大鼠空腹12h，擊頭處死,，剖腹取肝,，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干,。稱取肝組織2g,，剪碎，用預(yù)冷到0～4℃的0．25mol/L緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次,。然后在0～4℃條件下,，按每克肝加9ml冷的0．25mol/L緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應(yīng)分?jǐn)?shù)次添加,，勻漿用雙層尼龍織物過濾備用,。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間,，整個分離過程不宜過長,，以保持組分生理活性。
2．差速離心,。先將9ml 0．34mol/L緩沖蔗糖溶液放入離心管,，然后沿管壁小心地加入9ml肝勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍控溫高速離心機進行差速離心（見圖）,。
3．分離物鑒定,。
（1） 細(xì)胞核；取細(xì)胞核沉淀一滴涂片,，用甲醇—冰醋酸液固定15min,，充分吹干，滴姬姆薩染液（原液10～20倍稀釋）染色10min,。自來水沖洗,，吹干，鏡檢,。結(jié)果：細(xì)胞核紫紅色,，上面附著的少量胞質(zhì)為淺藍色碎片,。
（2） 線粒體；取線粒體沉淀涂片（注意勿太濃密）,，不待干即滴加1％詹納斯綠B染液染20min,，覆上蓋玻片，鏡檢,。線粒體藍綠色,，呈小棒狀或啞鈴狀。
如果使用不帶冷凍控溫的普通高速離心機操作,，應(yīng)盡量縮短操作時間,、注意樣品的冷凍，保持其生理活性,。
作 業(yè)
將線粒體沉淀作一涂片,，用姬姆薩染色，檢查是否混雜細(xì)胞核和胞質(zhì)碎片,，估計分離所得線粒體的純度,。根據(jù)你的實際體會，寫出操作注意事項及改進方法,。
思 考 題
1．分離介質(zhì)0．25mol/L及0．34mol/L緩沖蔗糖溶液哪一種在下層?有什么作用?
2．分離出的線粒體立即用詹納斯綠B染色和放置室溫2h后再染色，比較二者著色的差異,。
（一）,、材料
玉米黃化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）,。
（二）,、試劑
1．分離介質(zhì)；
0.25 mol/L蔗糖,，50mmol/L的Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4）,，3 mmo/L EDTA，0．75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）,。
50mmol/L的Tris—Hcl緩沖液（pH7．4）配法：
50ml 0．1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與42ml 0．1 mol/L鹽酸混勻后,，加水稀釋至100ml。
2．保存液：0．3mol/L甘露醇（pH7．4）
3．20％次氯酸鈉（NaClO）溶液,。
4．1％詹納斯綠B染液,，用生理鹽水配制。
（三）,、器材
溫箱,、冰箱、紗布,、瓷研缽,、冷凍控溫高速離心機。
從植物細(xì)胞分離線粒體，除了作線粒體功能測定外,，在植物細(xì)胞遺傳工程中,，常用于分離核外基因—線粒體DNA等目的。
分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差速離心,。介質(zhì)中0．25 mol/L蔗糖也可以用 0．3mol/L甘露醇代替,。EDTA整合二價陽離子，Ca2＋除去后細(xì)胞間粘著解體,，促使組織分散成單個細(xì)胞,。牛血清白蛋白（BSA）能包在細(xì)胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用,。
1．玉米種子用20％次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒,，清水沖洗30min，再浸泡清水15h,。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi),，保持濕度，置溫箱28℃于暗處培肓2～3d,。待芽長到1～2cm長時剪下約15g,，放0～4℃1h。
2．加3倍體積分離介質(zhì),，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿,。
3，用多層紗布過濾,，濾液經(jīng)700×g離心10min,。除去核和雜質(zhì)沉淀。
4,，取上清液10 000×g離心10min,，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次,。
5．沉淀為線粒體,，可存于0．3mol/L甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均控制在0～4℃進行,。
線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上,，不待干立即滴加1％詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片,，用顯微鏡觀察,，線粒體是藍綠色圓形顆粒。