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細(xì)胞活性測(cè)定方法
閱讀：7228 發(fā)布時(shí)間：2011-8-29| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 52KB |
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細(xì)胞活性測(cè)定方法
細(xì)胞活性測(cè)定方法有臺(tái)盼藍(lán)染色法,、克隆（集落）形成法,、3H放射性同位素?fù)饺敕ā?MTT法等,。其中MTT法以其快速簡(jiǎn)便，不需要特殊檢測(cè)儀器、無(wú)放射性同位素,、適合大批量檢測(cè)的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan 為水不溶性的,，需要加有機(jī)溶劑溶解，由于在去上清操作時(shí)會(huì)有可能帶走小部分的Formazan,，故有時(shí)重復(fù)性略差,。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究人員又開(kāi)發(fā)了很 多種水溶性的四氮唑鹽類(lèi)：如XTT,、CCK-8（WST-8）等,。
現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類(lèi)方法作一個(gè)簡(jiǎn)單介紹：
1.MTT法
MTT：化學(xué)名： 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán),。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中,，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的 甲 ,，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選,、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等,。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì),。
缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水,，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加,，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,，而且溶解甲 的有機(jī)溶劑對(duì) 實(shí)驗(yàn)者也有損害。
現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類(lèi)方法作一個(gè)簡(jiǎn)單介紹：
1.MTT法
MTT：化學(xué)名： 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán),。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中,，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的 甲 ,，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi),，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選,、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等,。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì),。
缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水,，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加,，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,，而且溶解甲 的有機(jī)溶劑對(duì) 實(shí)驗(yàn)者也有損害。
2.XTT法
XTT：化學(xué)名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide,，作為線粒體脫氫酶的作用底物,，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí),，其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。
優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞,；2,、檢測(cè)快速；3,、靈敏度高,，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；4,、重復(fù)性?xún)?yōu)于MTT,。
缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用,。
XTT：化學(xué)名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide,，作為線粒體脫氫酶的作用底物,，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí),，其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。
優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞,；2,、檢測(cè)快速；3,、靈敏度高,，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度；4,、重復(fù)性?xún)?yōu)于MTT,。
缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用,。
3.CCK-8法或稱(chēng)WST-8法
CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽],，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 （Formazan）。生成的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè),、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選,、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等,。
優(yōu)點(diǎn)：1,、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞,，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑,；2、檢測(cè)快速,；3,、靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度,；4,、重復(fù)性?xún)?yōu)于 MTT；5,、對(duì)細(xì)胞毒性?。?,、為1瓶溶液，毋需預(yù)制,，即開(kāi)即用,。
缺點(diǎn):1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴,。2,、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近,，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加,。
CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽],，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 （Formazan）。生成的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比,。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè),、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選,、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等,。
優(yōu)點(diǎn)：1,、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞,，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑,；2、檢測(cè)快速,；3,、靈敏度高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度,；4,、重復(fù)性?xún)?yōu)于 MTT；5,、對(duì)細(xì)胞毒性?。?,、為1瓶溶液，毋需預(yù)制,，即開(kāi)即用,。
缺點(diǎn):1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴,。2,、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近,，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加,。
三種方法的比較
| | MTT法 | XTT法 | CCK-8法（WST-8法） |
| 甲臜物水溶性 | 難溶性 | 水溶性 | 水溶性 |
| 檢測(cè)波長(zhǎng) | 490 nm | 450nm | 450nm |
| 性狀 | 粉末 | 2瓶溶液 | 1瓶溶液 |
| 使用方法 | 配成溶液后使用 | 現(xiàn)配現(xiàn)用 | 毋需預(yù)制 |
| 使用有機(jī)溶劑 | DMSO或其它溶劑 | — | — |
| 方便性 | + | ++ | +++ |
| 檢測(cè)速度 | + | ++ | +++ |
| 重復(fù)性 | + | ++ | ++ |
| 穩(wěn)定性 | ++ | + | ++ |
| 工作量 | --- | -- | - |
| 對(duì)細(xì)胞毒性 | --- | -- | - |
| 對(duì)人體毒性 | --- | - | - |
MTT原理、步驟,、結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng)
MTT原理
MTT全稱(chēng)為3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide,，漢語(yǔ)化學(xué)名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,，5-二苯基四氮唑溴鹽,，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料,。
MTT比色法,，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中,，而死細(xì)胞無(wú)此功能,。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值,，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量,。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比,。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè),、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等,。它的特點(diǎn)是靈敏度高,、經(jīng)濟(jì)。
缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水,，需被溶解后才能檢測(cè),。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害,。
缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水,，需被溶解后才能檢測(cè),。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響,，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害,。
MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml,。因此,，可以稱(chēng)取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中,，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌,，放4℃避光保存即可,。在配制和保存的過(guò)程中，容器用鋁箔紙包住,。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來(lái)避光,，覺(jué)得這樣比較好。
需要注意的是,，MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力,，但不能測(cè)定細(xì)胞數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候,，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性,，MTT吸光度在0-0.7范圍內(nèi)。
通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml,。因此,，可以稱(chēng)取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無(wú)酚紅的培養(yǎng)基中,，用0.22μm濾膜過(guò)濾以除去溶液里的細(xì)菌,，放4℃避光保存即可,。在配制和保存的過(guò)程中，容器用鋁箔紙包住,。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來(lái)避光,，覺(jué)得這樣比較好。
需要注意的是,，MTT法只能用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力,，但不能測(cè)定細(xì)胞數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候,，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性,，MTT吸光度在0-0.7范圍內(nèi)。
MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配,，過(guò)濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效,，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融,，小劑量分裝,，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解,。我一般都把MTT粉分裝在EP管里,，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加,，沒(méi)必要一下子配那么多,，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就不能再用了。
MTT有致癌性,，用的時(shí)候小心,，有條件帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無(wú)菌,，MTT對(duì)菌很敏感,；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短,，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉,。
配制MTT時(shí)用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl 8g ＋ KCl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4,，定容1L,。
普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：
1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板,，每孔體積200ul,。
2：培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）,。
3：呈色：培養(yǎng)3-5天后,，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制,，pH=7.4）20ul。繼續(xù)孵育4 h,，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,。每孔加150ul DMSO，振蕩10min,，使結(jié)晶物充分溶解,。
4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,，記錄結(jié)果,，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,。
1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板,，每孔體積200ul,。
2：培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）,。
3：呈色：培養(yǎng)3-5天后,，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制,，pH=7.4）20ul。繼續(xù)孵育4 h,，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液,。每孔加150ul DMSO，振蕩10min,，使結(jié)晶物充分溶解,。
4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,，記錄結(jié)果,，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,。
藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟
貼壁細(xì)胞：
1：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1000- 10000 孔,，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。
2：5%CO2,，37℃孵育,，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物,，原則上,，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí),，或半天時(shí)間,，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥,。一般5-7個(gè)梯度,，每孔100ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔,。建議設(shè)5個(gè),，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況
3：5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí),，倒置顯微鏡下觀察,。
4：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT）,，繼續(xù)培養(yǎng)4h,。若藥物與MTT能夠反應(yīng),，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后,，再加入含MTT的培養(yǎng)液,。
5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,。
6：每孔加入150ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值,。
7：同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT,、二甲基亞砜）,，對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì),、培養(yǎng)液,、MTT、二甲基亞砜）,。
貼壁細(xì)胞：
1：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度 1000- 10000 孔,，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。
2：5%CO2,，37℃孵育,，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物,，原則上,，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí),，或半天時(shí)間,，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥,。一般5-7個(gè)梯度,，每孔100ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔,。建議設(shè)5個(gè),，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況
3：5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí),，倒置顯微鏡下觀察,。
4：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT）,，繼續(xù)培養(yǎng)4h,。若藥物與MTT能夠反應(yīng),，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后,，再加入含MTT的培養(yǎng)液,。
5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,。
6：每孔加入150ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值,。
7：同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT,、二甲基亞砜）,，對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì),、培養(yǎng)液,、MTT、二甲基亞砜）,。
懸浮細(xì)胞：
1：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul,；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋?zhuān)▋?chǔ)存液100mg/ml,，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）,；③需檢測(cè)物10ul,；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）,。每板設(shè)對(duì)照（加100ml 1640）
1：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul,；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋?zhuān)▋?chǔ)存液100mg/ml,，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）,；③需檢測(cè)物10ul,；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）,。每板設(shè)對(duì)照（加100ml 1640）
2：置37℃,，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察,。
3：每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h,。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1,，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）
3：每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h,。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1,，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）
4,、離心（1000轉(zhuǎn)x10min）,，小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10 min,，使結(jié)晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。
5,、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基,、MTT、二甲基亞砜）,，對(duì)照孔（細(xì)胞,、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液,、MTT、二甲基亞砜）,，每組設(shè)定3復(fù)孔,。
注意事項(xiàng)：
（1） 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。
（2） 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn),。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液,。
（3） 設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致,，zui后比色以空白調(diào)零,。
（1） 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。
（2） 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn),。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液,。
（3） 設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致,，zui后比色以空白調(diào)零,。
（4） MTT實(shí)驗(yàn)吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系,。
（5） 用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做MTT測(cè)細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適根據(jù)書(shū)上說(shuō)的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液,，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定。
（6） 一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜,，既細(xì)胞濃度在20000個(gè)/ml,，MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液,，注意不要將甲臜洗掉,，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘,，然后測(cè)吸光值,。