化工儀器網(wǎng)
資料下載
人PR免疫組化試劑盒實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書
閱讀：759 發(fā)布時(shí)間：2015-10-23| 提 供 商 | 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司 | 資料大小 | 102.2KB |
|---|---|---|---|
| 資料圖片 | 查看 | 下載次數(shù) | 272次 |
| 資料類型 | PDF 文件 | 瀏覽次數(shù) | 759次 |
| 免費(fèi)下載 | 點(diǎn)擊下載 |
人PR免疫組化試劑盒
該試劑盒以HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin Conjugate,，HRP-SA）為基礎(chǔ),，可用于檢測(cè)細(xì)胞,、組織內(nèi)的特異性PR 抗原。該試劑盒具有靈敏度高,、特異性強(qiáng),、定性定位準(zhǔn)確、背景清晰,。在所用的PR 一抗與相應(yīng)靶抗原結(jié)合后,，用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合，zui后加入HRP-SA，形成抗原—特異一抗—生物素化二抗—HRP-SA 復(fù)合物,，顯微鏡下觀察成像,。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液：0.1% Triton-X 100 10 mL（選用）
試劑B 封閉緩沖液（封閉用） 20 mL
試劑C （*分裝）已稀釋的即用型PR 一抗（2.5ml）
試劑D （*分裝）生物素化羊抗兔IgG 1 支
（濃度1.5 mg/mL，稀釋比為1:300~1:500）50 μL+抗體稀釋液20ml試劑E HRP-SA 復(fù)合物1 支（濃度1 μM,，稀釋比1:50~1:200）100 μL試劑F DAB 顯色液 5ml
用戶自備試劑：
1． 10mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲烷1.21g
氯化鈉7.6g
加蒸餾水800mL,，濃鹽酸調(diào)pH 值至7.2~7.4，zui后定容至1000mLTBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復(fù)液（依檢測(cè)抗原不同而選擇不同的修復(fù)液）10mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水900mL,，濃鹽酸調(diào)pH 值至6.0,，zui后定容至1000mL
或：0.5M EDTA 修復(fù)液（pH8.0）
EDTA·2H2O 186.1g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水700mL，用10mM NaOH 調(diào)pH 值至8.0,，zui后定容至1000Ml
3. 緩沖甘油封固劑10 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上,，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3 次（即二甲苯Ⅰ,、Ⅱ,、Ⅲ），每次10 min,；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化,，無(wú)水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min）,，85%乙醇2 min,；75%乙醇2min，自來(lái)水沖洗,，ddH2O 洗2×2min,；
4.抗原修復(fù)： 根據(jù)抗體說(shuō)明書推薦方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓,、微波（溫度達(dá)到98~100℃）或酶消化修復(fù)法,，室溫自然冷卻，自來(lái)水沖洗,，ddH2O 洗2×2min,，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附1）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，直接進(jìn)入第5 步封閉,。
5.封閉： 滴加試劑B,，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗）,，37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過一夜,；
7.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑B,，37℃濕盒孵育10 min,；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D）,，37℃濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）,；
11.封閉： 滴加試劑Tween 20,，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200,，終濃度5~20 nM）,，37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T 洗滌（3×5 min）,，TBS 洗滌（2×5 min）,；
14.顯色：應(yīng)用DAB 溶液（試劑F）顯色；
15.復(fù)染：自來(lái)水充分沖洗,，復(fù)染,，脫水，透明,；
16.封片： 待組織標(biāo)本干后,，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像,。
注意事項(xiàng)：
1. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻,，自來(lái)水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導(dǎo)致結(jié)晶或抗原封閉,。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到,，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。
3. 若試劑為微量濃縮液,，用前應(yīng)低速離心,，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS 充分洗滌,，以便洗去組織上殘留的Tween 20,，否則會(huì)影響結(jié)果觀察。
5. 如須復(fù)染細(xì)胞核,，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封片,。
附1：
抗原修復(fù)方法
常用抗原修復(fù)液：檸檬酸緩沖液（0.01M pH6.0）,、EDTA 抗原修復(fù)液（pH8.0 或9.0）等等,。
一、酶消化修復(fù)法
切片脫蠟水化處理,，TBS 沖洗,，在組織上滴加胃蛋白酶或胰蛋白酶，37℃孵育20~30min 后TBS 沖洗即可,。
二,、微波抗原修復(fù)法
微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰,，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中,，中檔或繼續(xù)微波10~15min,，取出微波盒冷卻至室溫后，自來(lái)水沖洗,，取出切片,。因不同微波爐微波處理時(shí)間存在差異，須自行調(diào)整,。
三,、直接高壓抗原修復(fù)法
取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上,，修復(fù)液沸騰后放入切片架,，蓋上鍋蓋，待噴氣后計(jì)時(shí)1.5~2.5min 即可脫離熱源,，自然冷卻至室溫后自來(lái)水沖洗,，取出切片。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的修復(fù),。
四,、隔水式高壓抗原修復(fù)法
不銹鋼高壓鍋中加自來(lái)水加熱至沸騰，微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸騰,，將切片放入微波盒中,，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計(jì)時(shí)4~8 min 即可關(guān)閉熱源,，自然冷卻至室溫后自來(lái)水沖洗,，取出切片。此方法適用于較難檢測(cè)或核抗原的修復(fù),。