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                           Western 免疫印跡具體操作說(shuō)明書(shū)

上海恒遠(yuǎn)生物代做 Western 免疫印跡實(shí)驗(yàn)操作，咨詢關(guān)于實(shí)驗(yàn)的有關(guān)事項(xiàng),，感謝您對(duì)上海恒遠(yuǎn)生物的支持與信賴，祝您實(shí)驗(yàn)成功,。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. SDS-PAGE試劑:見(jiàn)電泳實(shí)驗(yàn),。
2. 勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml,；β-巰基乙醇 0.2ml,；ddH2O 2.8ml。
3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g,；Tris 5.8g,；SDS 0.37g；甲醇200ml,；加ddH2O定容至1000ml,。
4. 0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g,；Na2HPO4 1.44g,；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml,。
5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g,；甲醇80ml；乙酸2ml,；ddH2O118 ml,。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01M PBS中。
6. 顯色液：DAB 6.0mg,；0.01M PBS 10.0ml,；硫酸鎳胺 0.1ml；H2O2 1.0μl,。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后,，可通過(guò)電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液,，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min,。然后4℃，13,000g離心15min,。取上清液作為樣品,。
2. 電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE,。
3. 轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）

   (1) 電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小,，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，5min×3次,。

   (2) 膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。

   (3) 轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽(yáng)極碳板,、24層濾紙,、NC膜、凝膠,、24層濾紙,、陰極碳板的順序放好，濾紙,、凝膠,、NC膜對(duì)齊，每一步去除氣泡,，上壓500g重物,，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2,，轉(zhuǎn)移1.5hr,。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開(kāi)電源將膜取出,割取待測(cè)膜條做免疫印跡,。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色,，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色,，至背景清晰,，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對(duì)比,。
4. 免疫反應(yīng)：

   (1) 用0.01M PBS洗膜,，5min ×3次。

   (2) 加入包被液,，平穩(wěn)搖動(dòng),，室溫2hr。

   (3) 棄包被液,，用0.01M PBS洗膜,，5min×3次。

   (4) 加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋,，液體必須覆蓋膜的全部）,，4℃放置12hr以上。陰性對(duì)照,，以1%BSA取代一抗,，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

   (5) 棄一抗和1%BSA,，用0.01M PBS分別洗膜,，5min×4次。

   (6) 加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋）,，平穩(wěn)搖動(dòng),，室溫2hr。
   (7) 棄二抗,，用0.01M PBS洗膜，5min×4次,。

   (8) 加入顯色液,，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

注意事項(xiàng)

1. 一抗,、二抗的稀釋度,、作用時(shí)間和溫度對(duì)不同的蛋白要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件。
2. 顯色液必須新鮮配置使用,，zui后加入H2O2,。
3. DAB有致癌的潛在可能，操作時(shí)要小心仔細(xì),。