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本章解析:ELISA系統(tǒng)穩(wěn)定實驗更真實可靠

閱讀:1040          發(fā)布時間:2015-7-14

本章解析:ELISA系統(tǒng)穩(wěn)定實驗更真實可靠

ELISA檢測系統(tǒng)可謂是免疫學反應應用到科研生產(chǎn)中zui為靈敏的技術手段??墒窃谛吕鲜植僮鬟^程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題,,本人在剛開始做ELISA時就面臨很多困難,雖然有師兄師姐鋪路,,但還是常常做得一塌糊涂,,比如說花板,假陽性,全顯色,,全部顯色,,顯色比空白還低。,。,。。,。,。自己也為此苦惱過很長一段時間,隨著自己技術水平得提高,,或多或少地也掌握了ELISA體系的脾氣,,也是熟能生巧吧,現(xiàn)在做方陣,,做ELISA已是輕車熟路了,,以前檢測一種抗體用整整一下午還算得暈暈的,現(xiàn)在給我十個八個的從包被到顯色,,一個工作日基本搞定。下面就由我拋磚引玉地來說一下,,做ELISA的經(jīng)驗總結:

1,、包被原的性質(zhì)很重要,蛋白濃度,,是否降解,,這關系到你做出的抗體可不可以被其識別,所以保存抗原很重要,,我做重組蛋白時,,師兄都嚴格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白,,對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被,,我把方法簡要的列出如下:①親和素生物素:先親和素先包被載體,加入生物素化的DNA,,這種包被方法均勻,、牢固,已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定,。②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,,開蓋置冰箱過一夜或冷風吹干,待酒精揮發(fā)后,,讓脂質(zhì)自然干固在固相表面,。③小分子必須依靠和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。

2、包被液的選擇,,一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液,。但有時由于試驗的需要,包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包,。應注意以下原理:由于蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的,,靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用,這種物理吸附是非特異性的,,受蛋白質(zhì)的分子量,、等電點、濃度等的影響,,大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團,,故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐,,看一下zui終可不可以應用到自己試驗當中去,。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液,還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等,。

3,、封閉:繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙,,從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附,。常用封閉劑有:0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠,;脫脂奶粉,,比較價廉,可以高濃度使用(5%-10%),;還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等,。但zui終選用什么,要依據(jù)試驗具體來實踐,。

4,、洗滌板:可以說在ELISA操作中,洗滌是zui主要的關鍵技術,。因為聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,,為達到分離游離的和結合的酶標記物的目的,清除殘留在板孔中游離的物質(zhì),,以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì),,在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時會有一定誤差,,人為因素很大(當然有條件的用洗板機除外),,洗的不*或串了孔,,對如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響。

5,、加抗體標本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭,。標本稀釋一般可用pbs稀釋,也可用封閉液去稀釋,。如需加二抗,,還要注意二抗的工作濃度,太高浪費,,太低則著色淺,。

6、顯色:顯色系統(tǒng)又很多,,我們一開始做的時候,,要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結合物加硫柳泵,,AP結合物可加疊氮鈉,。

7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好,,如出現(xiàn)問題也好分析,。

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