技術(shù)文章
ELISA實(shí)驗(yàn)前必做的儀器和試劑準(zhǔn)備
閱讀:1061 發(fā)布時(shí)間:2015-4-13ELISA技術(shù)自20 世紀(jì)70年代初問世以來,,發(fā)展非常迅速,目前被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué),、醫(yī)學(xué),、生物學(xué)等許多領(lǐng)域,。其基本原理是根據(jù)抗原或抗體能在一定條件下結(jié)合到固相載體的表面仍保持其免疫活性,抗原或抗體與酶結(jié)合形成的結(jié)合物仍能保持免疫學(xué)和酶的活性,。結(jié)合物與相應(yīng)的抗原,、抗體結(jié)合后,可根據(jù)加入相應(yīng)的酶底物的顏色反應(yīng)來判斷有無相應(yīng)的免疫反應(yīng),,而且顏色的深淺與相應(yīng)的抗原或抗體的量在一定的范圍內(nèi)成正比,。由于抗原、抗體的反應(yīng)在1 種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行,,每加入一種試劑孵育后,,可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物,從而保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性,。了解實(shí)驗(yàn)原理后同時(shí)也必須做好實(shí)驗(yàn)的前期準(zhǔn)備,。
一、儀器準(zhǔn)備:
酶標(biāo)儀(ELISA Reader),,微量可調(diào)加樣器1套(10,、20、100,、200,、1000 μL),恒溫培養(yǎng)箱,,pH 計(jì),,沖洗器,洗滌瓶,,康氏管,,50 mL燒杯,吸管,。96孔酶標(biāo)板或48孔酶標(biāo)板,。
二、試劑準(zhǔn)備:
1)包被液:0.05 M pH9.6碳酸鹽緩沖液(Na2CO3 1.59 g, NaHCO3 2.93 g, 加水至1000 mL,,4℃可保存1周),。
2) 封閉液:5% 脫脂奶粉或0.3% BSA
3)洗滌液:0.15 M pH7.4 PBS-T(0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4?12H2O,8 g NaCl, 0.2 g NCl,0.5mL Tween-20,加水至1000 mL,4℃保存)
4)底物液:pH5.0 的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液(0.1 M 檸檬酸24.3 mL,,0.2 M磷酸鹽25.7 mL,,加水50 mL,混勻),,臨用前,,在上述緩沖液中溶解40 毫克鄰苯二胺(Ortho-Phenglendiaruine, OPD),然后加入30%雙氧水0.15 毫升,,底物對光敏感,,需要避光并立即使用。
5) 陽性對照液:1:100用HAT培養(yǎng)基稀釋的小鼠血清,。陰性對照液為HAT培養(yǎng)基
6) 辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 酶標(biāo)結(jié)合物,。
7) 2 M H2SO4
8) 抗原溶液