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    嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實驗設(shè)計中要求有良好的參照體系,，對實驗結(jié)果分析是非常有用,。特別是當(dāng)實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在,。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大?。瞻纵d體對照（如果是誘導(dǎo)表達體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對照）,，已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照,；另外還有內(nèi)參。內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細(xì)胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins),，它們在各組織和細(xì)胞中的表達相對恒定,，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。蛋白含量是肯定要測的,。首先合適的上樣蛋白,，western圖才比較比較美觀。而且對于需要半定量的western,，那是肯定要測含量后再做western了,。

1.marker呢，就相當(dāng)于一把標(biāo)尺,，用于驗證你的目的蛋白的分子量,，比如你的marker上有30和35kD的蛋白條帶，而你的目的蛋白是32kD,，跑膠以后你如果看到你的目的蛋白條帶在30和35kD之間,，就可以初步斷定是你的目的蛋白。

2. 內(nèi)參呢,，內(nèi)參也叫看家基因,，在組織或細(xì)胞中都會表達，且表達量在不同組織或細(xì)胞中幾乎是相同的,，一般有β-ACTIN,，GAPDH等。其作用有二,，1. 是看提取蛋白質(zhì)量的好壞,。如果做western的時候，內(nèi)參照蛋白有條帶,，而目的蛋白沒有,，說明蛋白的提取和轉(zhuǎn)膜等步驟沒有問題，是目的蛋白的抗體質(zhì)量不好或者是稀釋倍數(shù)不對,。2. 是比較客觀的說明目的蛋白的表達情況,，消除上樣量等的誤差。不同的標(biāo)本之間由于蛋白提取的量有差別,，可能強陽性的表達跑出來的帶很弱,。因此設(shè)立內(nèi)參照，比較不同標(biāo)本之間的表達情況,。

3. 測一下蛋白濃度再上樣,，這樣好點。當(dāng)然也看你的實驗室是定性還是定量了,，定性的話,，我覺得可以不用測濃度；要是準(zhǔn)備定量，還是盡量保證上樣量一致吧,。