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蛋白質(zhì)免疫印跡法實驗操作
閱讀：1815 發(fā)布時間：2014-12-22Western Blot印跡技術 根據(jù)上海恒遠了解,。1975,，Edwen Southern提出分子印跡概念,。 概念：將存在于凝膠中的生物大分子轉移（印跡）于固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術,。目前主要應用于DNA,RNA，蛋白質(zhì)的檢測,。 蛋白質(zhì)免疫印跡法 免疫印跡法 (Western blotting) 是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術相結合的雜交技術,。免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高,、特異性強等優(yōu)點,，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達與分布的一種zui常用的方法,，如組織抗原的定性定量檢測,、多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。 免疫印跡法(immunobiotting test,IBT)亦稱酶聯(lián)免疫電轉移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),因與Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法 Southern blot 相類似,，亦被稱為Western-blot. 應用 1 檢測樣品中特異蛋白存在與否 2 細胞中特異蛋白的半定量分析 3 蛋白質(zhì)分子相互作用的研究 試劑準備1,、SDS-PAGE試劑：見電泳實驗。 2,、勻漿緩沖液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml,；10%SDS 6.0ml,；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml,。 3,、轉膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g,；SDS 0.37g,；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml,。 4,、0.01M PBS(pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g,；Na2HPO4 1.44g,；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml,。 5,、膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2g；甲醇80ml,；乙酸2ml,；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉,，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中,。 6、顯色液：DAB 6.0mg,；0.01M PBS 10.0ml,；硫酸鎳胺 0.1ml；H202 1.0μl,。 操作步驟一蛋白質(zhì)樣品獲得：細菌誘導表達后,，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液,，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃,，13,000g離心15min,。取上清液作為樣品。 二電泳：制備電泳凝膠,，進行SDS-PAGE,。 三轉移：（半干式轉移） 1、電泳結束后將膠條割至合適大小,，用轉膜緩沖液平衡,，5min×3次,。 2、膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,，浸入轉膜緩沖液中10min,。 3、轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板,、24層濾紙,、NC膜、凝膠,、24層濾紙,、陰極碳板的順序放好，濾紙,、凝膠,、NC膜對齊，每一步去除氣泡,，上壓500g重物,，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,，恒流1mA/cm2,，轉移1.5hr。轉移結束后,，斷開電源將膜取出,，割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色,，放入膜染色液中50s后,，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰,，然后用雙蒸水洗,，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比,。 四免疫反應： 1,、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次,。 2,、加入包被液，平穩(wěn)搖動,，室溫2hr,。 3、棄包被液,，用0.01M PBS洗膜,，5min×3次,。 4、加入一抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋,，液體必須覆蓋膜的全部）,，4℃ 放置12hr以上。陰性對照,，以1%BSA取代一抗,，其余步驟與實驗組相同。 5,、棄一抗和1%BSA,，用0.01M PBS分別洗膜，5min×4次,。 6,、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋），平穩(wěn)搖動,，室溫2hr,。 7、棄二抗,，用0.01M PBS洗膜,，5min×4次。 8,、加入顯色液,，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應。 實驗操作 1 細胞裂解物的準備,； 2 細胞裂解物的蛋白定量,； 3 細胞裂解物的SDS-PAGE； 4 蛋白質(zhì)的轉移,； 6 目的蛋白質(zhì)的檢測,。 免疫印跡只能檢測目的蛋白的相對含量 測定相對含量時，需要內(nèi)參照 選擇合適的反應條件：SDS-PAGE膠濃度,；轉移膜的選擇,；轉移時間的選擇 注意電極的正負極 抗體反應時，注意驅除反應袋內(nèi)氣泡 操作要輕柔,。 |