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Elisa實(shí)驗(yàn)時(shí)*條件是什么？
閱讀：1292 發(fā)布時(shí)間：2014-11-3上海恒遠(yuǎn)生物分析ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理是用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體，往包被抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或者標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物顯色,。底物在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品濃度呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值,，計(jì)算樣品濃度。
在常見實(shí)驗(yàn)中,，Elisa是一種簡(jiǎn)單實(shí)用的測(cè)試方法,，那么Elisa實(shí)驗(yàn)時(shí)有哪些*條件，上海恒遠(yuǎn)生物為您詳情解答：
1．固相載體的選擇 載體的種類很多,，其中包括纖維素,、交聯(lián)右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等,。從使用形式上可有凹孔平板,、試管、珠粒等,。
聚苯乙烯凹孔板是應(yīng)用zui廣泛的一種載體,。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作簡(jiǎn)便,、用量小，適于大批檢查,。
由于聚苯乙烯的工藝過程不夠穩(wěn)定,造成各批次差異較大,。所以進(jìn)行ELISA之前,，必須進(jìn)行篩選,。檢查方法：
⑴ 吸附性能的檢查：先加抗體包被,，然后加入同一稀釋度的酶標(biāo)抗體，zui后加底物,、顯色,、測(cè)OD值,求出總平均OD值,再求出每相鄰兩孔的OD平均值,此均值在總均值的±10%以內(nèi)為合格,若中間孔與四周孔OD值相差太大，或一側(cè)與另一側(cè)孔OD值相差較大均屬不合格,。
⑵ 對(duì)比測(cè)定陽性血清與陰性血清,，觀察是否存在明顯差異，若二者OD值相差于10倍以上者為合格,。
板的處理,。新板一般不用處理,用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用。板用一次即廢,。但不少實(shí)驗(yàn)工作者認(rèn)為用超聲波處理,，清潔液Tritonx100、20%乙二醇處理仍可應(yīng)用,。但發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照顯色較深和陽性樣品顯色結(jié)果不理想時(shí),，應(yīng)棄去不用。
2．載體的吸附條件 載體的吸附均為物理吸附,。吸附的多少取決于PH值,、溫度、蛋白濃度,、離子強(qiáng)度以及吸附時(shí)間等,。
較好的吸附條件是：離子強(qiáng)度為0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸鹽緩沖液，蛋白濃度為1µg/ml~100µg/ml,，4℃過一夜或37℃3h,。
3．酶標(biāo)抗體使用濃度的確定 于聚苯乙烯板孔中加足夠量的抗體包被,溫育一定時(shí)間，沖洗,、把酶標(biāo)結(jié)合物倍比稀釋,，每個(gè)稀釋度加2孔,溫育、沖洗,、再加底物顯色,、比色。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),酶標(biāo)結(jié)合物的稀釋度為橫坐標(biāo),，制作曲線,。找出OD值為1時(shí)，相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗體稀釋度為zui適酶標(biāo)抗體稀釋度,。
這個(gè)稀釋度是指在這種條件下的zui適稀釋度,，換個(gè)條件就不是zui適的了。如1﹕400的酶標(biāo)抗體稀釋度溫育6h可與1︰6 400稀釋度溫育24h結(jié)果相同,。所以一旦條件確定之后,，就不要變更，以保證結(jié)果的重復(fù)性和相對(duì)的準(zhǔn)確性,。
此zui適酶標(biāo)抗體稀釋度可做為工作濃度,，也可提高半個(gè)至一個(gè)滴度，但不能提高過高,，否則非特異性顯色增加,。
酶標(biāo)抗體的滴度反映酶標(biāo)抗體的質(zhì)量，也可以此比較酶標(biāo)結(jié)合物的優(yōu)劣,。有材料報(bào)道認(rèn)為1︰320滴度為合格,1︰1 000以上更好,。酶標(biāo)抗體滴度越高，用于工作濃度的稀釋倍數(shù)就越大,，敏感性就越高,，非特異性反應(yīng)就越低。
4．抗原：
⑴ 抗原的要求：
用于ELISA的抗原必須采用相當(dāng)純的抗原,，如果含有其它雜質(zhì),，將與抗原共同競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置。用于其它血清學(xué)反應(yīng)的抗原不一定能適用ELISA實(shí)驗(yàn),，必須經(jīng)過試驗(yàn),，抗原必須能牢固地吸附于載體上，而不喪失其免疫活性,，且可得到有規(guī)律的重復(fù)的結(jié)果,。另外在吸附載體后，對(duì)加入的各種試劑產(chǎn)生zui小的非特異性吸附，即與陰,、陽性血清結(jié)合差異較大,。
⑵ 抗原效價(jià)的測(cè)定 可采用單方陣或雙方陣試驗(yàn)。①單方陣試驗(yàn)：以不同稀釋度的抗原包被酶標(biāo)板,，以常規(guī)的1﹕200倍稀釋的陽性血清加入,，再加入酶標(biāo)抗體、顯色,、測(cè)OD值,，以O(shè)D值為1.0時(shí)，相應(yīng)的抗原濃度作為使用效價(jià),；②雙方陣試驗(yàn)比較,，它既能測(cè)出抗原的zui適濃度又能測(cè)出抗體的zui適濃度。即將抗原抗體均稀釋成不同濃度進(jìn)行酶標(biāo)抗體反應(yīng),，以血清稀釋倍數(shù)zui高的陰,、陽性血清的光吸收值差zui大的所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為抗原的使用效價(jià)。
已吸附的抗原的固相載體經(jīng)凍干或干燥保存很穩(wěn)定,數(shù)月仍不失活,。
5．清洗液 一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐溫緩沖液,。吐溫是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),常做助溶劑,。吐溫的編號(hào)依聚合山梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而定,。吐溫20是結(jié)合月桂酸,、吐溫40是結(jié)合棕櫚酸,、吐溫60是結(jié)合硬脂酸,吐溫80是結(jié)合油酸等。通常用吐溫20加入緩沖液內(nèi)做為濕潤(rùn)劑,以減少非特異性吸附,。也可在PBS緩沖液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特別在抗原包被以后,以牛血清白蛋白緩沖液再包被一次,而占據(jù)孔內(nèi)剩下位置,這樣來減少非特異性反應(yīng),。
6．反應(yīng)時(shí)間 抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在37℃ 2h～3h達(dá)到高峰,。時(shí)間太短,敏感性下降,時(shí)間太長(zhǎng),吸附的抗原或復(fù)合物(在這個(gè)溫度下)可能脫落,。
7．抗體 抗體效價(jià)的測(cè)定同抗原,采用雙方陣試驗(yàn)。
酶底物反應(yīng)時(shí)間的確定：一般采用15min～30min～45min,。也可以標(biāo)準(zhǔn)陽性血清為準(zhǔn),隨時(shí)測(cè)定其OD值,當(dāng)達(dá)到規(guī)定的OD值時(shí),即終止反應(yīng),。
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