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IHC/ICC如何降低非特異相互作用
閱讀：2424 發(fā)布時(shí)間：2014-6-25所有IHC/ICC研究都依賴(lài)特異的抗體-抗原表位結(jié)合,，這是由疏水相互作用,、氫鍵及其它分子間作用力來(lái)控制的。不過(guò),，相同的吸引力也可能引起非特異染色,，即一抗與目的抗原表位之外的氨基酸結(jié)合。這是IHC/ICC實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常存在的一個(gè)問(wèn)題,。我們的挑戰(zhàn)在于如何降低非特異相互作用,，而不損害抗體-表位的結(jié)合。上海恒遠(yuǎn)生物為您精彩分享,。
非特異染色的原因包括一抗和二抗與血清蛋白的相互作用,，抗體與組織之間的離子相互作用，以及與能夠影響IHC檢測(cè)系統(tǒng)的內(nèi)源分子的相互作用,。這些問(wèn)題會(huì)產(chǎn)生高背景,，以及無(wú)法在適當(dāng)?shù)募?xì)胞位置觀察目的抗原。這種類(lèi)型的染色問(wèn)題可通過(guò)用封閉劑來(lái)封閉非特異相互作用來(lái)解決,。在將樣本與一抗共同孵育之前,，可開(kāi)展這些步驟。
預(yù)防非特異疏水相互作用
盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體的結(jié)合中起了重要作用,，但這些力同樣能促進(jìn)非特異結(jié)合,。由于一些氨基酸的中性側(cè)鏈，大部分蛋白有著某種程度的疏水性,。將組織與熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）共同孵育,，是降低非特異疏水結(jié)合的常用步驟。正常血清類(lèi)型的選擇對(duì)預(yù)防與一抗或二抗的相互作用,，或預(yù)防與待染色組織/細(xì)胞的相互作用很重要,。例如，在使用山羊來(lái)源的一抗時(shí),，不建議用山羊血清作為封閉劑,。而是推薦與二抗的宿主動(dòng)物相同的血清或來(lái)自不相關(guān)物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑,。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中,。非離子去污劑如0.3% Triton X-100™或Tween 20™的添加也能降低非特異疏水相互作用。
預(yù)防非特異離子相互作用
如果使用的抗體與目的組織有著相反的凈電荷,，那么離子相互作用可能導(dǎo)致非特異的背景染色,。例如，非特異染色可能來(lái)自相反的羧基和氨基相互作用,。范德華力,、兩級(jí)分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體稀釋液的離子強(qiáng)度能降低離子相互作用,。不過(guò),，表位-抗體結(jié)合通常依賴(lài)于離子強(qiáng)度，因此這種方法也可能負(fù)面影響染色特異性,。由于單克隆抗體的單表位特異性,，與多克隆抗體相比，增加離子強(qiáng)度更可能損害其性能,。
內(nèi)源酶的干擾
顯色檢測(cè)法常使用一種結(jié)合的酶來(lái)觀察表位-抗體的相互作用,。在使用這種檢測(cè)方法時(shí)，同一種酶的內(nèi)源活性必須被封閉,。例如,，包含辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的操作步驟可能需要試劑來(lái)防止非特異信號(hào)。腎,、肝或帶有紅細(xì)胞的血管區(qū)域等組織含有內(nèi)源的過(guò)氧化物酶活性,。由3-10% H2O2配制而成的過(guò)氧化物酶封閉液能用于防止內(nèi)源的過(guò)氧化物酶切割底物。內(nèi)源的堿性磷酸酶主要在腸,、腎,、淋巴及其它組織中發(fā)現(xiàn)，能被1 mM 左旋咪唑（Levamisole）封閉,。堿性磷酸酶的腸道形式不受左旋咪唑影響,，但能用1% 乙酸封閉,。
內(nèi)源的生物素干擾
鏈親和素與生物素化的一抗或二抗結(jié)合，是IHC/ICC實(shí)驗(yàn)常用的另一種檢測(cè)系統(tǒng),。因此,，在鏈親和素孵育之前，內(nèi)源的生物素必須被封閉,。內(nèi)源的生物素在多個(gè)組織中發(fā)現(xiàn),，包括肝、腎,、心臟,、腦和肺。樣本與親和素（avidin）預(yù)先孵育,，通?？煞忾]內(nèi)源的生物素。接下來(lái)必須與生物素共同孵育,，以封閉親和素分子上多余的生物素結(jié)合位點(diǎn),。在這些生物素/親和素封閉步驟之后，樣本才能與一抗孵育,。
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